生物技術(shù)制藥-第七章 發(fā)酵工程技術(shù)

第二章

發(fā)酵工程制藥

第一節(jié)概述一、發(fā)酵工程 微生物工程:利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供技術(shù)服務(wù)的技術(shù)。涉及到生命體的繁殖、生長(zhǎng)、生產(chǎn)、衰老等過(guò)程，實(shí)質(zhì)上是一個(gè)非常復(fù)雜的自催化過(guò)程。發(fā)酵工程是生物技術(shù)的基礎(chǔ)，其他技術(shù)如基因工程、細(xì)胞工程、酶工程等都與發(fā)酵工程密切相關(guān)。發(fā)酵中的化學(xué)反應(yīng)是通過(guò)微生物完整細(xì)胞的綜合生物化學(xué)過(guò)程實(shí)現(xiàn)，在發(fā)酵工業(yè)中，要求微生物細(xì)胞既能正常生長(zhǎng)，又能過(guò)量積累目的產(chǎn)物。現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)已形成完整的體系，包括抗生素、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、多糖、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、基因工程藥物、核算類物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)。(一)發(fā)酵的定義1、傳統(tǒng)發(fā)酵

最初發(fā)酵是用來(lái)描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過(guò)程。2、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵指微生物在無(wú)氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴(yán)格地說(shuō)，發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。如葡萄糖在無(wú)氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出CO2。3、工業(yè)上的發(fā)酵

泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過(guò)程,包括：1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過(guò)程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過(guò)程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。產(chǎn)品有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細(xì)胞、酶等。(二)發(fā)酵工業(yè)定義：是指利用生物的生命活動(dòng)產(chǎn)生的酶，無(wú)機(jī)或有機(jī)原料進(jìn)行酶加工，獲得產(chǎn)品的工業(yè)。發(fā)酵食品有機(jī)酸氨基酸核酸類物質(zhì)酶制劑醫(yī)藥工業(yè)（抗生素…）飼料工業(yè)（單細(xì)胞蛋白環(huán)境工程（廢物處理）其它（冶金工業(yè)…）抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等(1)傳統(tǒng)生物技術(shù)(2)現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程菌發(fā)酵二、發(fā)酵類型

1、微生物菌體發(fā)酵定義：是以獲得具有多種用途的微生物菌體細(xì)胞為目的的產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)，包括單細(xì)胞的酵母和藻類、擔(dān)子菌，生物防治的蘇云金桿菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。藥用微生物制劑等。特點(diǎn)：細(xì)胞的生長(zhǎng)與產(chǎn)物積累成平行關(guān)系，生長(zhǎng)速率最大時(shí)期也是產(chǎn)物合成速率最高階段，生長(zhǎng)穩(wěn)定期產(chǎn)量最高。2、微生物的酶目前的酶多數(shù)來(lái)源于微生物發(fā)酵醫(yī)用酶制劑的生產(chǎn)醫(yī)藥工業(yè)用酶酶的特點(diǎn)：易于工業(yè)化生產(chǎn)，便于改善工藝提高產(chǎn)量。生物合成特點(diǎn)：需要誘導(dǎo)作用，或遭受阻遏、抑制等調(diào)控作用的影響，在菌種選育、培養(yǎng)基配制以及發(fā)酵條件等方面需給予注意。3、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵包括初級(jí)代謝產(chǎn)物、中間代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期形成的產(chǎn)物是細(xì)胞自身生長(zhǎng)所必需的，稱為初級(jí)代謝產(chǎn)物或中間代謝產(chǎn)物。各種次級(jí)代謝產(chǎn)物都是在微生物生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)時(shí)期即穩(wěn)定期所產(chǎn)生的，來(lái)自于中間代謝產(chǎn)物和初級(jí)代謝產(chǎn)物。1,3-丙二醇兩步發(fā)酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎桿菌、丁酸梭菌等4、微生物的生物轉(zhuǎn)化定義：是利用生物細(xì)胞對(duì)一些化合物某一特定部位（基團(tuán)）的作用，使它轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相類似但具有更多經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物。最終產(chǎn)物是由微生物細(xì)胞的酶或酶系對(duì)底物某一特定部位進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而形成的。三、微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類（一）抗生素類9000種微生物發(fā)酵占70％。有價(jià)值的抗生素，幾乎全部由微生物生產(chǎn)抗細(xì)菌，病毒，真菌，腫瘤，原蟲(chóng)，寄生蟲(chóng)等（二）氨基酸類單個(gè)氨基酸制劑：復(fù)方氨基酸制劑：

微生物發(fā)酵法：酶轉(zhuǎn)化法黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑（三）核苷酸類肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，輔酶等（四）維生素類維生素C的原料藥2-酮基-古龍酸，維生素A的前體B-類胡蘿卜素，維生素D2的前體麥角甾醇，維生素B2，B12等（四）甾體類激素甾體類激素的生產(chǎn)過(guò)程中，一些特異反應(yīng)需借助微生物的反應(yīng)。（五）治療酶及酶抑制劑藥用酶酶抑制劑四、發(fā)酵工程制藥特點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)（1）菌種是根本（2）理論產(chǎn)量存在“生物學(xué)變量”（3）常溫常壓下反應(yīng)，安全，條件簡(jiǎn)單（4）純種培養(yǎng)，防污染（5）可制備復(fù)雜高分子化合物（6）分子水平，定向發(fā)酵，組合生物合成等（7）發(fā)酵工業(yè)成本低菌種選育自然界選種、誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實(shí)踐中需多次試驗(yàn)配方滅菌殺滅雜菌（胞體、孢子及芽孢）擴(kuò)大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過(guò)程（中心階段）檢測(cè)進(jìn)程，滿足營(yíng)養(yǎng)需要；嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等分離純化菌體：過(guò)濾、沉淀；代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換發(fā)酵工程基本流程發(fā)酵的基本過(guò)程發(fā)酵的基本過(guò)程:菌種種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理提取精制菌種菌種的性能質(zhì)量，包括菌種的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)繁殖情況和代謝特性決定了發(fā)酵水平的高低。要求：產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)。保藏：休眠狀態(tài)保存在冷凍干燥管中，放于0~4度恒溫冰箱內(nèi)。臨時(shí)取出接種后仍需冷藏。使用期：砂土管中為1~2年菌種應(yīng)不斷純化，淘汰變異菌落，防止衰退。種子制備使菌種繁殖，以獲得足夠數(shù)量的菌體，以便接種到發(fā)酵罐中。發(fā)酵使微生物產(chǎn)生大量的目的產(chǎn)物，是發(fā)酵的關(guān)鍵階段。產(chǎn)物提取發(fā)酵液是一種混合物，提取過(guò)程包括：①發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾；②提?。虎劬频湫桶l(fā)酵過(guò)程發(fā)酵工程的發(fā)展現(xiàn)代意義上的發(fā)酵工程是一個(gè)由多學(xué)科交叉、融合而形成的技術(shù)性和應(yīng)用性較強(qiáng)的開(kāi)放性的學(xué)科。“農(nóng)產(chǎn)手工加工——近代發(fā)酵工程——現(xiàn)代發(fā)酵工程”。發(fā)酵工程的發(fā)展第一階段：利用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡萄酒、酒、醋、醬、奶酪等食品。憑借經(jīng)驗(yàn)、探索本質(zhì)巴斯德為發(fā)酵工程提供了理論基礎(chǔ)，被譽(yù)為生物工程之父。第二階段：1900-1940，新的發(fā)酵產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，主要有酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丁醇和丙酮等。梭菌引起丙酮、丁醇發(fā)酵，服務(wù)于戰(zhàn)爭(zhēng)的彈藥制造。丁醇的制備時(shí)第一個(gè)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵過(guò)程，也是工業(yè)生產(chǎn)中首次采用大量純培養(yǎng)技術(shù)的工藝，而這一個(gè)工藝成功的重要因素是：排除了培養(yǎng)體系中其他有害微生物，在該時(shí)期是相當(dāng)先進(jìn)的生物技術(shù)。第三階段：發(fā)酵工業(yè)大發(fā)展時(shí)期，青霉素工業(yè)化成功地推動(dòng)了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。主要標(biāo)志有：深層培養(yǎng)、生產(chǎn)大規(guī)模化，多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功，甾體的微生物轉(zhuǎn)化等。該階段采用純種發(fā)酵，進(jìn)行無(wú)菌操作，對(duì)操作條件有嚴(yán)格的控制，相應(yīng)地采用較復(fù)雜的工藝和設(shè)備。1929年，F(xiàn)leming發(fā)現(xiàn)青霉素，但當(dāng)時(shí)無(wú)法提取精制。第二次世界大戰(zhàn)促使實(shí)現(xiàn)了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。1942年，以青霉素工業(yè)生產(chǎn)為標(biāo)志深層通氣培養(yǎng)法的建立標(biāo)示了發(fā)酵工程發(fā)展的一次新飛躍。預(yù)示著發(fā)酵工程從厭氧發(fā)酵為主的工藝躍入深層通氣發(fā)酵為主的工藝，該工藝的區(qū)別不僅僅是通氣，更是與此相適應(yīng)的一整套工程技術(shù)，如大量滅菌空氣的制備、中間無(wú)菌取樣技術(shù)、大罐無(wú)菌操作和管理技術(shù)、產(chǎn)品分離提純技術(shù)、設(shè)備的設(shè)計(jì)技術(shù)等。1944年，第二個(gè)抗生素鏈霉素誕生第四階段，基因工程等高新技術(shù)應(yīng)用階段。提出DNA雙螺旋模型發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的“質(zhì)?！笔悄茉诩?xì)菌染色體外進(jìn)行自我繁殖的細(xì)胞質(zhì)因子（基因操作起點(diǎn)）DNA限制酶和連接酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵過(guò)程各種參數(shù)與動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與自動(dòng)控制、產(chǎn)品的分離純化和精制發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個(gè)要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和發(fā)酵設(shè)備。第二節(jié)、發(fā)酵工程中的微生物一、常見(jiàn)的藥用微生物發(fā)酵工程所利用的微生物主要是細(xì)菌、放線菌，酵母菌和霉菌細(xì)菌放線菌（一）細(xì)菌主要生產(chǎn)氨基酸，核苷酸，維生素等（二）放線菌產(chǎn)抗生素最多的一類微生物另外生產(chǎn)B12,酶，甾體轉(zhuǎn)化抗生素是次級(jí)代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來(lái)源如下：放線菌（鏈霉素；四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動(dòng)物來(lái)源鏈霉菌（三）真菌抗生素維生素酶制劑有機(jī)酸等藥用真菌（大型真菌）1.藻狀菌綱：根霉；犁頭霉2.子囊菌綱：酵母3.擔(dān)子菌綱：牛肝菌，靈芝4.半知菌綱：曲霉；青霉；頭孢酶二、生產(chǎn)菌種的選育工業(yè)化菌種的要求1.遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定2.生長(zhǎng)速度快，不易感染它種微生物或噬菌體3.目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量接近理論轉(zhuǎn)化值4.目標(biāo)產(chǎn)物分泌到胞外5.盡可能減少類似物產(chǎn)量6.能夠利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物優(yōu)良菌種是發(fā)酵工程產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。自然界中分離的野生型菌種在產(chǎn)量和質(zhì)量上都不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，必須通過(guò)人工培育。優(yōu)良菌種的選育不僅為發(fā)酵工業(yè)提供高產(chǎn)菌株，還可以提供各種類型的突變菌株。菌種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳物質(zhì)支配著各種酶在生物體內(nèi)有條不紊的行使其功能。DNA分子結(jié)構(gòu)的改變時(shí)誘變育種的工作基礎(chǔ)，染色體搭配的變化交換是雜交育種的根據(jù)。對(duì)DNA分子結(jié)構(gòu)和它復(fù)制過(guò)程的了解江有利于充實(shí)誘變育種的理論根據(jù)你。質(zhì)粒也是遺傳物質(zhì)，是染色體外的遺傳結(jié)構(gòu)，能在細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，并能離開(kāi)染色體單獨(dú)存在。許多質(zhì)粒攜帶一些能影響宿主細(xì)胞類型的基因。菌種選育包括自然選育、誘變選育、雜交選育等經(jīng)驗(yàn)育種方法，同時(shí)包括控制雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等定向育種方法。自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。（1）自然選育利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程自然選育就是將正突變菌株挑選出來(lái)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。該方法可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)水平、提高產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，但是效率低、進(jìn)展慢。1采樣2.分離菌株自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。平板分離(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)單細(xì)胞(孢子)懸液的制備挑選單菌落禮來(lái)公司花了10年的時(shí)間從40萬(wàn)株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。（2)自發(fā)突變與定向育種一定情況下，長(zhǎng)期處理微生物并移種，累積自發(fā)突變體結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。篩選抗性株，可成為高產(chǎn)株抗性突變株的篩選直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn)菌種選育突變、體內(nèi)重組體外重組（基因工程）（3）誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種微生物在生理和形態(tài)上的變化只要是可遺傳的都稱為變異。變異~~環(huán)境變化而出現(xiàn)的變化誘變機(jī)制三種類型：微小損傷突變、染色體畸變（大損傷突變）、染色體組突變。1、微小損傷突變堿基置換：ACC->GCC=>色氨酸UGG->精氨酸CGG，蛋白質(zhì)發(fā)生改變碼組移動(dòng)突變：在DNA分子的某一位置缺失或插入一對(duì)或幾對(duì)核苷酸堿基而使遺傳密碼移位。2、染色體畸變（大損傷突變）由遺傳物質(zhì)的缺失、重復(fù)或重排而造成的染色體異常突變。包括一條染色體內(nèi)發(fā)生的畸變和非同源染色體之間發(fā)生的畸變易位：非同源染色體之間部分相連接的現(xiàn)象。倒位：染色體的某一部分以顛倒的順序出現(xiàn)在原來(lái)位置上缺失：染色體上失去一個(gè)或多個(gè)基因遺傳物質(zhì)的節(jié)段重復(fù)：染色體上增加一段染色體片段，使同一染色體上某些基因重復(fù)出現(xiàn)。注意易位和倒位都使基因排列順序改變，而基因數(shù)目不變。對(duì)染色體畸變而言，缺失是指足夠長(zhǎng)的DNA片段的缺失，而不是單個(gè)核苷酸的缺失（碼組移動(dòng)突變）。3、染色體組突變指由有絲分裂或減數(shù)分裂異常而產(chǎn)生的染色體數(shù)目或組數(shù)的變化。誘變劑誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍,5-Br-U{生物：噬菌體物理誘變劑：紫外線、X-射線、γ-射線，快中子；目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過(guò)紫外線，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全?；瘜W(xué)誘變劑：金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料、堿基類似物、5-氟尿嘧啶、烷化劑等。使用最多、最有效的是烷化劑。大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效根據(jù)化學(xué)誘變因素對(duì)DNA的作用形式可分為三類：與一個(gè)或多個(gè)核酸堿基起化學(xué)變化，引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致變異。亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等與天然堿基十分接近的類似物摻入到DNA分子中而引起變異，如5-溴尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤等DNA分子上減少或增加一兩個(gè)堿基引起堿基突變點(diǎn)以下全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯錯(cuò)誤（碼組移動(dòng)突變），如吖啶類物質(zhì)。誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選篩選的方法

隨機(jī)篩選

形態(tài)

理性化篩選（4）雜交育種通過(guò)有性生殖進(jìn)行(5)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)：指通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。意義：打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)。可與其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個(gè)單株中。原生質(zhì)體融合育種去除了細(xì)胞壁障礙，親株基因組直接融合、交換、重組，在融合后兩親株的基因組之間有機(jī)會(huì)發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種各樣的基因重組，得到多種類型的重組子，并可進(jìn)行多級(jí)融合（即兩個(gè)以上的親株融合）。融合重組頻率高，可用溫度、藥物或紫外線照射處理來(lái)純化親株一方或雙方，然后再融合、再生、篩選重組子。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、重組頻率高，是一種很有效的遺傳育種手段，已用它來(lái)改良菌株，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，而且能打破種屬界限，產(chǎn)生重組子，并可能產(chǎn)生新化合物。去細(xì)胞壁融合篩選溶壁作用：不同菌株要求不同酶，細(xì)菌、放線菌可用溶菌酶；酵母用蝸牛酶；霉菌用纖維素酶和蝸牛酶融合：原生質(zhì)球在高滲溶液中用PEG助融篩選：融合后在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選融合重組子。原生質(zhì)體融合的一般程序菌齡：采用對(duì)數(shù)前期的菌體進(jìn)行酶解，原生質(zhì)體形成率高培養(yǎng)基：選用限制性培養(yǎng)基PEG：引起凝集，有利原生質(zhì)體間的親和外界因素：高滲溶液、再生培養(yǎng)基中加酵母膏促進(jìn)再生影響融合的因素基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進(jìn)化：點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR、同序法DNAShuffling等（6）基因重組進(jìn)化育種錯(cuò)位PCR基本步驟(1)用DNaseI消化功能相同的一組基因片段(A)，從而產(chǎn)生隨機(jī)小片段(B)。(2)經(jīng)提純后，用無(wú)引物(經(jīng)變性后可互為引物)的類似PCR反應(yīng)重新裝配這些小片段成完整長(zhǎng)度的重組基因片段(C)，在裝記過(guò)程中被證明有低水平點(diǎn)突變產(chǎn)生。3)克隆并選擇正突變體(D)，并將正突變體的重組基因片段作新一輪的體外重組。項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對(duì)象進(jìn)化周期影響對(duì)象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個(gè)基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較篩選合理的篩選方法和程序是菌種選育的重要問(wèn)題，其中初步篩選是關(guān)鍵性的步驟?？股氐挠N中初篩一般選擇隨機(jī)篩選方法，從中選出產(chǎn)量最高者進(jìn)一步復(fù)篩，該方法較為可靠，但工作量大，需進(jìn)行大量篩選。為提高篩選效果，根據(jù)抗生素生物合成直接或間接有關(guān)的某些性狀進(jìn)行初步篩選，然后在合適條件下發(fā)酵并測(cè)定其生產(chǎn)抗生素的能力，即“理性化篩選”。從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。具有較大實(shí)用性的有三種1.自身耐藥突變株2.結(jié)構(gòu)類似物或前體類似物的耐受突變株3.營(yíng)養(yǎng)缺陷及其回復(fù)突變株理性化篩選飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營(yíng)養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營(yíng)養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)三、菌種保藏在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長(zhǎng)期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程極為重要。斜面低溫法：短期保存石蠟油封存法：中期保存沙土管：產(chǎn)孢子和芽孢的麩皮保存法：產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌，工廠用甘油懸液法：基因工程菌凍干保藏：最廣泛使用的方法。大部分菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久。且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸液氮法：最為有效，保藏15年以上，宿主保藏法：活細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物第三節(jié)、發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌一、發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵罐是發(fā)酵工程中最重要的設(shè)備之一

一個(gè)優(yōu)良的培養(yǎng)裝置應(yīng)具有：嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)良好的液體混合性能高的傳質(zhì)和傳熱速率靈敏的檢測(cè)和控制儀表1、攪拌釜式反應(yīng)器：目前使用

最廣泛的發(fā)酵反應(yīng)器機(jī)械攪拌發(fā)酵罐1）適宜的徑高比，罐身較長(zhǎng)，氧利用率較高2）能耐受一定的壓力3）攪拌通風(fēng)裝置4）足夠的冷卻面積5）罐內(nèi)要減少死角6）攪拌器的軸封要嚴(yán)密，以減少泄露罐體：培養(yǎng)微生物的巨大容器，密閉式的，在發(fā)酵過(guò)程中要保持一定的罐壓，通常滅菌的壓力約為2.5×105

Pa形狀，圓柱形，兩端橢圓形,受力均勻，減少死角，物料容易排除，高度與直徑比1.7-4：1，有力空氣利用率攪拌器檔板克服攪拌器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)液體產(chǎn)生的渦流，將徑向流動(dòng)改變?yōu)檩S向流動(dòng)，促使液體激烈翻動(dòng)，增加溶氧速率消泡器鋸齒式、梳狀式及孔板式裝于攪拌軸上，齒面略高于液面直徑罐徑的0.8~0.9罐體表面各種裝置：

中大型發(fā)酵罐裝有供維修、清洗的入孔罐頂裝有窺鏡和孔燈，在其內(nèi)面裝有壓縮空氣或蒸汽吹管罐頂接管：進(jìn)料管、補(bǔ)料管、排氣管、接種管、壓力表接管罐身接管：冷卻水進(jìn)出管、空氣進(jìn)管、溫度計(jì)管和測(cè)控儀器接口（二）發(fā)酵輔助設(shè)備無(wú)菌空氣系統(tǒng)：過(guò)濾除菌（使用活性炭，石棉濾板，多孔合成樹(shù)脂等）滅菌系統(tǒng)發(fā)酵車間的管道閥門(mén)等發(fā)酵對(duì)無(wú)菌空氣的要求是：無(wú)菌，無(wú)灰塵，無(wú)雜質(zhì)，無(wú)水，無(wú)油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)；發(fā)酵對(duì)無(wú)菌空氣的無(wú)菌程度要求是：只要在發(fā)酵過(guò)程中不因無(wú)菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過(guò)，即經(jīng)過(guò)濾后空氣的無(wú)菌程度為N=10-3

高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個(gè)數(shù)量級(jí)因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。

油水分離器其內(nèi)部同時(shí)采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴(kuò)散及凝聚等機(jī)理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長(zhǎng)。

發(fā)酵車間的空氣過(guò)濾器二、培養(yǎng)基和滅菌（一）培養(yǎng)基C源：N源：無(wú)機(jī)鹽：前體，促進(jìn)劑，抑制劑2.培養(yǎng)基的類型孢子培養(yǎng)基：一般用固體培養(yǎng)基，N源不能豐富如：小米或麩皮培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：速效的C,N源，與發(fā)酵培養(yǎng)基過(guò)渡發(fā)酵培養(yǎng)基：遲效與速效的C,N源搭配，加前體等（二）滅菌方法1.空罐滅菌：高壓水蒸氣，消滅死角當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對(duì)罐進(jìn)行預(yù)先滅菌蒸汽下進(jìn)上出2.實(shí)罐滅菌：效果最好，121度，30-50分鐘三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。3.連續(xù)滅菌：營(yíng)養(yǎng)破壞最少，128-138度，8-12分鐘。發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品二、種子的制備

種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。谷氨酸生產(chǎn)的種子制備斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵1、斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次2.一級(jí)種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12h培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3.二級(jí)種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32℃培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過(guò)程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過(guò)程為生產(chǎn)車間階段。種子制備的過(guò)程二、微生物的發(fā)酵方式分批發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵一、分批發(fā)酵

簡(jiǎn)單的過(guò)程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒(méi)有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個(gè)過(guò)程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點(diǎn)產(chǎn)率低，不適于測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分批培養(yǎng)中微生物的生長(zhǎng)遲滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期死亡期遲滯期，菌體沒(méi)有分裂只有生長(zhǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，細(xì)胞開(kāi)始分裂，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)很快。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，進(jìn)入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進(jìn)入死亡期對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期就開(kāi)始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期大量合成。二、補(bǔ)料分批培養(yǎng)在分批培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過(guò)早結(jié)束的缺點(diǎn)。在此過(guò)程中只有料液的加入沒(méi)有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開(kāi)始時(shí)有所增加。在工廠的實(shí)際生產(chǎn)中采用這種方法很多補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過(guò)補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點(diǎn)由于沒(méi)有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)三、半連續(xù)培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)基礎(chǔ)上，加上間歇放掉部分發(fā)酵液進(jìn)入下游提取的操作方式。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點(diǎn)代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大四、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過(guò)程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。1.罐式連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)液以一定的流速不斷地流加到帶機(jī)械攪拌的發(fā)酵罐中，與罐內(nèi)發(fā)酵液充分混合，同時(shí)帶有細(xì)胞和產(chǎn)物的發(fā)酵液又以同樣流速連續(xù)流出。如果用一個(gè)裝置將流出的發(fā)酵液中部分細(xì)胞返回發(fā)酵罐，就構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)。2.管式連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵液通過(guò)沒(méi)有混返的管狀反應(yīng)器向前流動(dòng)管道的形式有多種，如直線形、S形、蛇形管等。培養(yǎng)液和從種子罐來(lái)的種子不斷流入管道發(fā)酵器內(nèi)，使微生物在其中生長(zhǎng)。這種連續(xù)發(fā)酵的方法主要用于厭氧發(fā)酵。如在管道中用隔板加以分隔，每一個(gè)分隔等于一臺(tái)發(fā)酵罐，就相當(dāng)于多罐串聯(lián)的連續(xù)發(fā)酵。

連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：控制稀釋速率可以使發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長(zhǎng)，得到高的產(chǎn)量。通過(guò)改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)缺點(diǎn)：菌種不穩(wěn)定的話，長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)料染菌機(jī)會(huì)大大增加。發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點(diǎn)菌種本身的代謝特點(diǎn)，生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性，溫度、pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等三、發(fā)酵過(guò)程中的中間分析項(xiàng)目（一）產(chǎn)量發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物的積累，以發(fā)酵單位表示化學(xué)測(cè)定法：簡(jiǎn)單，但受結(jié)構(gòu)類似物的影響，發(fā)酵過(guò)程中采用。生物測(cè)定法：麻煩，人為誤差大。發(fā)酵終點(diǎn)采用（二）PHpH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)-酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映-基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、供氧狀況（三）糖糖的消耗反映產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖情況；反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長(zhǎng)旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每焱ㄟ^(guò)糖含量的測(cè)定，可以控制菌體生長(zhǎng)速率，可控制補(bǔ)糖來(lái)調(diào)節(jié)pH，促進(jìn)產(chǎn)物合成，不致于盲目補(bǔ)糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測(cè)定包括總糖和還原糖。總糖指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。（四）氨基氮氨基氮指有機(jī)氮中的氮氮利用快慢可分析出菌體生長(zhǎng)情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。有些產(chǎn)物合成受到過(guò)量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過(guò)氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過(guò)程，適時(shí)采取補(bǔ)氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時(shí)就要放罐，否則影響提取過(guò)程。（五）菌絲形態(tài)四、發(fā)酵過(guò)程的影響因素及控制發(fā)酵過(guò)程控制是發(fā)酵的重要部分同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會(huì)得到不同的結(jié)果，可見(jiàn)發(fā)酵過(guò)程的影響因素是復(fù)雜的，比如設(shè)備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時(shí)間的長(zhǎng)短，發(fā)酵過(guò)程的細(xì)微差別都會(huì)引起微生物代謝的不同。了解和掌握分析發(fā)酵過(guò)程的一般方法對(duì)于控制代謝是十分必要的（一）菌體濃度的影響及控制菌體濃度反應(yīng)菌體細(xì)胞數(shù)和勝利特性結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的生物，分裂所需時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)酵中菌液需控制在合理濃度中，過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快，有毒廢物積累，改變菌體代謝途徑，影響溶氧；過(guò)低，產(chǎn)率下降依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和補(bǔ)料控制菌體濃度（二）培養(yǎng)基的影響及其控制1.碳源葡萄糖速效碳源，生長(zhǎng)菌體淀粉等遲效碳源，發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營(yíng)養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。2.氮源氨基酸，玉米漿等速效氮源，生長(zhǎng)菌體豆餅等遲效氮源，發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。有些產(chǎn)物合成受到過(guò)量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。3.磷酸鹽和微量元素微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來(lái)計(jì)算磷含量的是磷酸根抗生素對(duì)磷酸鹽濃度很敏感生長(zhǎng)濃度：0.32-300M生產(chǎn)濃度：1.0M采用生長(zhǎng)亞適量磷酸鹽濃度4.補(bǔ)料補(bǔ)基質(zhì)和前體中途補(bǔ)料，豐富培養(yǎng)基，避免菌體過(guò)早衰老，控制PH，改善通氣等通常在生長(zhǎng)旺盛期后期，發(fā)酵液泡沫位下降，這時(shí)耗氧大，溶氧水平接近臨界點(diǎn)補(bǔ)料少量多次（三）溫度的影響及其控制1、溫度影響反應(yīng)速率發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。另外，溫度影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于30C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到35C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。1.影響發(fā)酵溫度變化的因素(1)生物熱微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。(2)攪拌熱(3)蒸發(fā)熱通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱(4)輻射熱發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過(guò)罐體向外輻射。2.溫度的選擇與控制(1)最適溫度的選擇嗜冷菌適應(yīng)于0～26度生長(zhǎng)，嗜溫菌適應(yīng)于15～43度生長(zhǎng)，嗜熱菌適應(yīng)于37～65度生長(zhǎng)，嗜高溫菌適應(yīng)于65度以上生長(zhǎng)最適生長(zhǎng)溫度不一定最適生產(chǎn)（發(fā)酵）溫度最適發(fā)酵溫度受菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段等影響。理論上來(lái)講，發(fā)酵過(guò)程不應(yīng)只選一個(gè)溫度，應(yīng)根據(jù)不同階段選擇不同的培養(yǎng)溫度：生長(zhǎng)階段：最適生長(zhǎng)溫度產(chǎn)物分泌階段：最適生產(chǎn)溫度實(shí)際中……發(fā)酵前期要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長(zhǎng)迅速；中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長(zhǎng)階段28C，合成期26C后期再升溫；黑曲霉生長(zhǎng)37C，產(chǎn)糖化酶32～34C。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長(zhǎng)溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)30～32C，產(chǎn)酸34～37C。(2)溫度的控制冷卻水（四）pH的影響及其控制pH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)——

酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、供氧狀況通過(guò)觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否1、發(fā)酵過(guò)程的pH控制發(fā)酵過(guò)程中pH是不斷變化的，通過(guò)觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否2、產(chǎn)物形成某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升實(shí)例：pH對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響林可霉素發(fā)酵開(kāi)始，葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機(jī)酸被生產(chǎn)菌利用，pH上升。若不及時(shí)補(bǔ)糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制某些酶系，使林可霉素增長(zhǎng)緩慢，甚至停止。對(duì)照罐發(fā)酵66小時(shí)pH達(dá)7.93，以后維持在8.0以上至115小時(shí)，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。發(fā)酵15小時(shí)左右，pH值可以從消后的6.5左右下降到5.3，調(diào)節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。發(fā)酵過(guò)程pH變化的原因

（1）糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一（2）氮代謝：當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降1.調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH。基礎(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5－6.8２.在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3

，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等３.通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH４.當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH（五）溶氧的影響及其控制溶氧(DO)是需氧微生物生長(zhǎng)所必需。在發(fā)酵過(guò)程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。供氧不足，代謝異常通氣，攪拌1.溶氧的影響在28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25M左右，比糖的溶解度小7000倍。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即使發(fā)酵液中的溶氧能達(dá)到100％空氣飽和度，若此時(shí)中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾秒（分）鐘之內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素2.發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化發(fā)酵初期，生產(chǎn)菌大量繁殖，需氧，溶氧下降過(guò)了生長(zhǎng)階段，需氧減少，溶氧上升發(fā)酵中后期，分批發(fā)酵的溶氧不變生產(chǎn)后期，菌體衰老，溶氧上升溶氧異常變化：明顯降低或升高，常見(jiàn)是溶氧下降。（原因：耗氧或供養(yǎng)出現(xiàn)了異常因素或發(fā)生了障礙，見(jiàn)p273）3.溶氧濃度的控制通氣，攪拌補(bǔ)料調(diào)節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度能提高溶氧濃度）液化培養(yǎng)基中間補(bǔ)水添加表面活性劑（六）CO2的影響及控制CO2是微生物代謝產(chǎn)物，溶解在發(fā)酵液中的CO2對(duì)發(fā)酵有刺激或抑制作用CO2和HCO3影響膜的結(jié)構(gòu)CO2使PH下降影響菌體的呼吸速率等CO2對(duì)產(chǎn)物抑制，則降低濃度，對(duì)產(chǎn)物促進(jìn)，則增加濃度降低通氣攪拌，則增加CO2在發(fā)酵液中溶解度（七）發(fā)酵過(guò)程泡沫的形成與控制發(fā)酵過(guò)程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過(guò)多的泡沫是有害的泡沫產(chǎn)生的