液相色譜常見故障

液相色譜常見故障診狀

可能的原因

解決方法

(一)保留時間變化1.柱溫變化柱恒溫

2.等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動相平衡柱

3.緩沖液容量不夠用>25mmol/L的緩沖液

4.柱污染每天沖洗柱

5.柱內條件變化穩(wěn)定進樣條件,調節(jié)流動相

6.柱快達到壽命采用保護柱(二)保留時間縮短1.流速增加檢查泵,重新設定流速

2.樣品超載降低樣品量

3.鍵合相流失流動相PH值保持在3~7.5

檢查柱的方向

4.流動相組成變化防止流動相蒸發(fā)或沉淀

5.溫度增加柱恒溫(三)保留時間延長

1.流速下降管路泄漏,更換泵密封圈,

排除泵內氣泡

2.硅膠柱上活性點變化用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱

3.鍵合相流失同前(二)34.流動相組成變化同前(二)45.溫度降低同前(二)5(四)

出現肩峰或分叉1.樣品體積過大用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.樣品溶劑過強采用較弱的樣品溶劑3.柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.柱內燒結不銹鋼失效更換燒結不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.進樣器損壞更換進樣器轉子(五)鬼峰1.進樣閥殘余峰每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗2.樣品中未知物處理樣品3.柱未平衡重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑

(尤其是離子對色譜)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)每天新配,用抗氧化劑5.水污染(反相)通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水(六)

基線噪聲1.氣泡(尖銳峰)流動相脫氣,加柱后背壓2.污染(隨機噪聲)清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑3.檢測器燈連續(xù)噪聲更換氘燈4.電干擾(偶然噪聲)采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.檢測器中有氣泡流動相脫氣,加柱后背壓(七)峰拖尾1.柱超載降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.峰干擾清潔樣品,調整流動相3.硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死體積或柱外體積過大連接點降至最低,對所有連接點作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管7.柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱(八)峰展寬1.進樣體積過大同(四)12.在進樣閥中造成峰擴展進樣前后排出氣泡以降低擴散3.數據系統(tǒng)采樣速率太慢設定速率應是每峰大于10點4.檢測器時間常數過大設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%5.流動相粘度過高增加柱溫,采用低粘度流動相6.檢測池體積過大用小體積池,卸下熱交換器7.保留時間過長等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫8.柱外體積過大將連接管徑和連接管長度降至最小9.樣品過載進小濃度小體積樣品泵的操作與維護正如人的心臟一樣,高效液相色譜儀中的高壓恒流泵必須能可靠的運轉.但是要做到長時間低維護的可靠運轉,就需要對泵有足夠的了解,并注意與之有關的事項.

1.通常的設計

目前作為商品出售的高壓恒流泵多為往復式柱塞泵,結構原理如圖1所示.凸輪與連桿將電機的圓周運動轉變?yōu)橹麠U的線性運動,在有單向閥的結構中,柱塞桿將常壓下儲液瓶中的流動相吸至泵腔后再送出,其耐壓可達41MPa.通過改變凸輪的形狀和電機的轉速及柱塞桿的尺寸可以將流動相的脈動降至最小.如果對泵的各個部分都有清楚的認識,將來排出操作過程中出現的故障就很簡單了.單向閥:泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿.

是單向閥的示意圖.該單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成.在壓力的作用下寶石球離開閥座流動相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上此時流動相不再流過單向閥.顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏.為了保證單向閥不發(fā)生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上.在不同的應用領域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統(tǒng),單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不銹鋼.為了降低成本和減少維護費用,一些生產廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當然其功能仍保持不變柱塞桿與密封圈:柱塞桿在泵頭內做前后的往復運動,完成將流動相吸入泵頭然后再輸出的過程.柱塞桿的典型材料藍寶石,不銹鋼或其他材質的柱塞桿往往用于一些特殊的領域.泵頭內的密封圈是防止流動相從柱塞桿的周圍流走而設計的.

是柱塞桿的運動過程示意圖.

在吸液過程中由于柱塞桿的運動而在泵腔內形成負壓.此時因色譜柱的,泵頭外的壓力顯然高于泵頭內,在這兩種壓差下出口單向閥的寶石球落回到閥座上;而對于入口單向閥,因為外界大氣壓大于泵腔內的壓力,寶石球離開閥座,流動相順利的進入泵腔.與此相反的輸液過程見圖3-b.由于柱塞桿的運動使壓力增加,入口單向閥的寶石球落回到閥座,入口單向閥處于關閉狀態(tài);當泵頭內的壓力繼續(xù)增加,并且超過了泵頭外的色譜柱的反壓時,出口單向閥開啟,流動相輸出.進樣閥在進樣過程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結果。進樣閥切換到進樣位置（Inject）后，要在此位置保持一段時間，使流動相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再沖洗樣品定量管。這種由色譜儀器控制的沖洗顯然要比手動沖洗更好些。注意：沖洗需要的流動相體積至少為所進樣品體積的10倍。例如，如果取20μL樣品至100μL樣品定量管中，而流動相此時的流速為1mL/min，則需要在進樣位置至少保持12s，即：20μL×10/1000μL·min-1=0.2min=12s。

當樣品定量管經過充分的沖洗后，可以將旋柄轉回取樣位置（Load），也可以繼續(xù)保持在進樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時，將樣品進樣針或微量樣品進樣針從進樣閥中拔出。

為防止交叉污染，正常情況下不必每次進樣后都沖洗進樣閥注射針導入口。進樣閥內根據專利設計的直接連接進樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進樣時，就不會有上一次殘留的樣品進入樣品定量管。但是在進樣針頭插入或拔出過程中，會有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測定顯示這種殘留有1nL~10nL。這表明進20μL樣品，會殘留0.005%~0.05%。每次進樣后沖洗注射針導入口可以將此殘留沖洗干凈。沖洗注射針導入口的過程為：設定流動相的流速為0.1mL/min~1mL/min，將注射針導入口沖洗頭（Rheodyne部件號7125-054）連接到一只體積相對較大的注射器上，用大量的流動相只在進樣位置清洗注射針導入口。這樣進入進樣閥中的液體繞過樣品定量管由樣品溢出管5#口排出。這一過程可以將注射針導入口、引導管、注射針導入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部分的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導入口時，針頭推動注射針密封圈內少量樣品液體（上一次沖洗注射針導入管留下的）進入樣品定量管。當該樣品液體與所用的流動相組成不同，且同時采用部分充滿定量管進樣方式時，在高靈敏度的檢測器上可能出現怪峰。所以沖洗注射針時最好用流動相沖洗。如果已發(fā)現有嚴重的交叉污染現象，請檢查是否有下列原因造成：

ⅰ.使用的注射針頭長度不夠（針頭的長度至少要5cm），注射針末端不能到達定子表面。

ⅱ.注射針沒有充分插入注射針導入口。

ⅲ.注射針導入口內的污染物或針頭密封磨損下來的削片，使注射針頭末端不能接觸定子表面。

如果不考慮交叉污染，每進樣10次或20次最好沖洗一下注射針導入口，這樣可以保證注射針導入管內充滿流體。在注射針插入或拔出的過程中，清洗注射針頭或稀釋污染這一區(qū)域的樣品的同時也使注射針導入口和樣品