第五章紫外可見分光光度法

第五章紫外可見分光光度法

UltravioletandVisible(UV-Vis)Spectrophotometry

1第五章紫外可見分光光度法第一節(jié)分子吸收光譜概述；第二節(jié)

光吸收基本定律；第三節(jié)儀器部件及其類型；第四節(jié)顯色反應(yīng)及其影響因素第五節(jié)定性分析和定量分析方法及其應(yīng)用。25.1概述一、分子吸收光譜的形成1.過程：運(yùn)動的分子外層電子--------吸收外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收譜。2.能級組成：除了電子能級(Electronenergylevel)外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動和轉(zhuǎn)動，即同時將發(fā)生振動(Vibration)能級和轉(zhuǎn)動(Rotation)能級的躍遷！據(jù)量子力學(xué)理論，分子的振-轉(zhuǎn)躍遷也是量子化的或者說將產(chǎn)生非連續(xù)譜。34分子的三種能級躍遷示意圖

分子吸收外來輻射能后，其能量改變（ΔE）為：ΔE=ΔEe+ΔEv+ΔEr對多數(shù)分子而言，ΔEe

（電子）約為1-20ev，紫外可見ΔEv

（振動）約為0.05-1ev，近紅外、中紅外區(qū)ΔEr

（轉(zhuǎn)動）小于0.05ev，遠(yuǎn)紅外、微波區(qū)ΔEe>ΔEv>ΔEr5二、物質(zhì)對光的選擇性吸收●物質(zhì)的顏色由物質(zhì)與光的相互作用方式?jīng)Q定?！袢搜勰芨杏X到的光稱可見光，波長范圍是：400~760nm。●讓白光通過棱鏡，能色散出紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫等各色光?！駟紊猓簡我徊ㄩL的光●復(fù)合光：由不同波長的光組合而成的光，如白光。●光的互補(bǔ)：若兩種不同顏色的單色光按一定比例混合得到白光，

稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。6分子吸收現(xiàn)象CuSO4溶液吸收黃色光,其溶液呈現(xiàn)出藍(lán)色；KMnO4分子強(qiáng)烈地吸黃綠色光，對其他顏色的光吸收很少或不吸收，溶液呈紫紅色。問題：Na2SO4溶液無色透明,其分子吸光情況?

CuS(固態(tài))呈黑色，其分子吸光又如何？700nm530nm420nm580nm470nm620nm7物質(zhì)的顏色：是由于物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。

即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補(bǔ)色。無色溶液：透過所有顏色的光有色溶液：透過光的顏色黑色：吸收所有顏色的光白色：反射所有顏色的光物質(zhì)的本色8

基于物質(zhì)吸收紫外或可見光引起分子中價電子躍遷、產(chǎn)生分子吸收光譜與物質(zhì)組分之間的關(guān)系建立起來的分析方法，稱為紫外-可見吸光光度法（UV-vis）三、紫外-可見吸光光度法特點(diǎn)（1）靈敏度高，可測到10-7g/ml。（2）準(zhǔn)確度好，相對誤差為1%-5%，滿足微量組分測定要求。（3）選擇性好，多種組分共存，無需分離直接測定某物質(zhì)。（4）操作簡便、快速、選擇性好、儀器設(shè)備簡單、便宜。（5）應(yīng)用廣泛，無機(jī)、有機(jī)物均可測定。91011三、電子躍遷的類型

121.-*躍遷能量差大所需能量高吸收峰在遠(yuǎn)紫外(<150nm)

甲烷:125nm；乙烷:135nm2.-*躍遷能量差較小所需能量較低吸收峰紫外區(qū)(200nm左右)3.n-*躍遷能量較低收峰紫外區(qū)(200nm左右)（與-*接近）三甲基胺(CH3)3N-的n-*吸收峰在227nm134.n-*躍遷能量低吸收峰在近紫外、可見區(qū)(200~700nm)含有雜原子的不飽和基團(tuán)，如-C=O，-CN等各種躍遷所需能量大小次序?yàn)椋?/p>

-*>n-*

-*>n-*14基本概念1、生色團(tuán)具有軌道的不飽和官能團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。有“共軛大鍵”（離域鍵）時，與*間的能量差減小，生色作用大大增強(qiáng)。2、助色團(tuán)

本身不“生色”，但能使生色團(tuán)生色效應(yīng)增強(qiáng)的官能團(tuán)。含有孤對電子的基團(tuán)：

—NH2—OH—SH153、紅移和紫移紅移：吸收峰向長λ移動的現(xiàn)象；紫移：吸收峰向短λ移動的現(xiàn)象；增強(qiáng)效應(yīng)：吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象；減弱效應(yīng)：吸收強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。

16四、

吸收光譜

吸收光譜(吸收曲線):吸光度（A）~波長（）吸收峰：曲線上比左右相鄰處都高的一處；

max：吸收程度最大所對應(yīng)的

谷：曲線上比左右相鄰處都低的一處；

min：最低谷所對應(yīng)的；肩峰：介于峰與谷之間，形狀像肩的弱吸收峰；17吸收曲線示意圖

18五、無機(jī)化合物的吸收光譜1、金屬離子：d電子躍遷稀土離子：f電子躍遷2、配合物電荷轉(zhuǎn)移

Fe3+—SCN-Fe2+—SCNhv195.2Lambert-Beer定律一、透射比和吸光度I0=Ia+It+IrI0——入射光強(qiáng)度Ia

——吸收光強(qiáng)度It——透過光強(qiáng)度Ir

——反射光強(qiáng)度20

若吸收池的質(zhì)量和厚度都相同，則Ir

基本不變，在具體測定操作時Ir

的影響可互相抵消（與吸光物質(zhì)的c及b

無關(guān)）：

I0=Ia+It

采用空白溶液作為參比：測量前在比色皿中裝上空白溶液，測量此時的透過光強(qiáng)度It。21對光吸收程度表示：透光率：T=It/I0

吸光度：A=lg(1/T)=lg(I0

/It)T=10%時，A=1.0空白測定：設(shè)定空白溶液的吸光度為0，即透過率T＝100％。22二、Lambert-Beer定律

——光吸收基本定律“

Lambert-Beer定律”是說明物質(zhì)對單色光吸收的強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)的濃度（c）和液層厚度（b）間的關(guān)系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可見光度法定量的基礎(chǔ)。23Lambert-Beer定律推導(dǎo)24A=

lc吸收介質(zhì)之間沒有相互作用吸光度具有加合性25Lambert定律：A=k'lBeer定律：A=k"cLambert-Beer定律：A=klc當(dāng)c用g/L、b

用cm為單位時，k用吸光系數(shù)a

表示，單位為L/g·cm當(dāng)c用mol/L、b

用cm為單位時，k用摩爾吸光系數(shù)表示，單位為L/mol·cm

26光吸收定律的有關(guān)名稱和符號27吸光度的加和性

設(shè)某一波長（）的輻射通過幾個相同厚度的不同溶液c1，c2···cn，其透射光強(qiáng)度分別為I1，I2···In，根據(jù)吸光度定義：這一吸光體系的總吸光度為：

A=lgI0/In

A1+A2+···+An=lgI0/I1+lgI1/I2+···+lgIn-1/In=lgI0/In

A=lgI0/In=A1+A2+···+An28三、引起偏離Lambert-Beer定律的因素

1.吸收定律本身的局限性

稀溶液中才能成立（吸收介質(zhì)之間沒有相互作用）2.化學(xué)因素

Cr2O42-+H2O2CrO42-+2H+

3.儀器因素（非單色光的影響）4.其它光學(xué)因素：散射和反射、非平行光295.3紫外-可見分光光度計(jì)

一、主要部件

光

源

單色器

信號輸出

檢測器

樣品池301.光源：提供入射光的裝置；（1）鎢燈或碘鎢燈

>350nm，可見光（2）氫燈或氘燈：

150~400nm，紫外光（3）氙燈

200~700nmUVregionVisibleregion312.單色器：色散元件：光柵狹縫準(zhǔn)光鏡聚焦元件光源色散元件入射狹縫323.吸收池：

光學(xué)玻璃吸收池

——只能用于可見區(qū)

石英吸收池

——可用于紫外及可見區(qū)334.檢測器：硒光電池光電管光電倍增管二極管陣列photochathodeanodehighvoltagevoltagedividernetworkdynodeslightelectrons34LightLensEntranceSlitRotatingGratingExitSlitDetectorMeasureonewavelengthbandatatime.Serialdetectionscheme.ArrayDetectorMeasurealargerangeofwavelengthssimultaneously.Paralleldetectionscheme.355.顯示器：電表指針數(shù)字顯示熒光屏顯示電腦36二.分光光度計(jì)的類型

1.單波長、單光束分光光度計(jì)（721、722、752型等）一個單色器；一種波長的單色光；一束單色光。2.單波長雙光束分光光度計(jì)從一個單色器獲取一個波長的單色光用切光器分成二束強(qiáng)度相等的單色光，消除了光源不穩(wěn)定性。373.雙光束雙波長分光光度計(jì)二個單色器得到二個波長不同的單色光。兩束波長不同的單色光（

1、

2

）交替地通過同一試樣溶液（同一吸收池）后照射到同一光電倍增管上，最后得到的是溶液對

1和

2兩束光的吸光度差值?A。38SinglebeamDoublebeamDoubleλ,doublebeamSourceλselectorSampleTransducerOutputSourceλselectorSampleTransducerOutputBlankSourceλ2selectorTransducerOutputλ1selectorSample39三、分光光度計(jì)的校正通常在實(shí)驗(yàn)室工作中，驗(yàn)收新儀器或?qū)嶒?yàn)室使用過一段時間后都要進(jìn)行波長校正和吸光度校正。建議采用下述的較為簡便和實(shí)用的方法來進(jìn)行校正：A.鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計(jì)的波長標(biāo)尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對紫外和可見光區(qū)都適用。B.也可用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度標(biāo)度。40§5—4顯色反應(yīng)及其影響因素一．顯色反應(yīng)和顯色劑：（一）顯色反應(yīng)：在光度分析中將試樣中的待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)一般分為兩大類：一類是配位反應(yīng)；另一類是氧化還原反應(yīng)。Fe3＋＋SCN－=FeSCN－；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在這兩類反應(yīng)中，用得較多的是配位反應(yīng)。41（二）顯色劑：與待測組分生成有色化合物的試劑叫顯色劑；1．無機(jī)顯色劑：許多無機(jī)試劑能與金屬離子形成有色化合物，如銅離子與氨可生成深藍(lán)色的化合物。但由于多數(shù)無機(jī)顯色劑的選擇性和靈敏度不夠高，所以無機(jī)顯色劑用的比較少。其中較好的，現(xiàn)在還在使用的無機(jī)顯色劑主要有硫氰酸鹽、鉬酸鹽、過氧化氫等少量幾種。422．有機(jī)顯色劑：1）優(yōu)點(diǎn)：

a．具有鮮明的顏色，ε都很大（一般可達(dá)到104以上），所以測定的靈敏度很高；b．生成的一般為螯合物，穩(wěn)定性很好，一般離解常數(shù)都很?。籧．選擇性好d．有些有色配合物易溶于有機(jī)溶劑，可進(jìn)行萃取光度分析，提高了測定的靈敏度和選擇性。433．常見的有機(jī)顯色劑：1．磺基水楊酸：其結(jié)構(gòu)式如下：它可用于測定三價鐵離子。442．鄰二氮菲（鄰菲羅啉，1，10—二氮菲）：結(jié)構(gòu)式為：直接在PH=3～9時與Fe2+生成紅色螯合物。用于鐵的測定。453．雙硫腙：也叫二苯—硫腙。結(jié)構(gòu)式為：測定很多重金屬離子，如：鉛、鋅、銅、銀、汞、鎘等。46二．選擇顯色反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)：1．選擇性要好：2．靈敏度要高：3．有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。4．顯色劑的顏色與有色化合物的顏色差別要大5．反應(yīng)的條件要易于控制。47三．影響顯色反應(yīng)的因素：（一）顯色劑用量：顯色反應(yīng)就是將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)，其反應(yīng)一般可用下式代表：M＋R=MR反應(yīng)具有一定的可逆性，當(dāng)加入過量R的用量時，有利于反應(yīng)向右進(jìn)行。48但要注意，加入的顯色劑用量也不能太多，否則產(chǎn)生副反應(yīng)，對測定產(chǎn)生不利。例如：用SCN-與Fe3+反應(yīng)生成紅色配合物測定鐵時，當(dāng)加入的顯色劑太多時，就會對測定產(chǎn)生不利。對于不同的情況，顯色劑的用量對顯色反應(yīng)的影響是不同的。在實(shí)際選用時，一般是通過實(shí)驗(yàn)來確定的。49實(shí)驗(yàn)的方法為：固定待測組分的濃度和其它條件，分別加入不同量的顯色劑，分別測定它們的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，顯色劑用量為橫坐標(biāo)作圖，可得到吸光度—顯色劑用量的曲線，其結(jié)果分為三種情況：50（二）溶液酸度：酸度對顯色反應(yīng)的影響很大，因?yàn)槿芤核岫戎苯佑绊懼饘匐x子、顯色劑的存在形式和有色化合物的組成、穩(wěn)定性等。1．酸度對金屬離子存在形式的影響：很多高價金屬離子都要水解，酸度較低時，不利于顯色反應(yīng)的進(jìn)行。512．酸度對顯色劑濃度的影響：很多顯色劑都是有機(jī)弱酸，在溶液中有如下平衡：HRH+＋R－而顯色反應(yīng)為M＋RMR所以酸度太高對反應(yīng)不利。523．酸度對顯色劑顏色的影響：很多顯色劑本身就是酸堿指示劑，酸度不同時，它們的顏色不同。如果控制不好酸度，就會使指示劑顏色與有色化合物的顏色相近而影響測定。比如：用二甲酚橙為顯色劑，它與金屬離子形成的配合物為紅色，它本身在PH<6.3時為檸檬黃色，而在PH＞6.3時為紅紫色。所以在PH＞6.3時，就無法進(jìn)行測定。534．酸度對配合物組成的影響：有些顯色反應(yīng)當(dāng)酸度不同時，要生成配位比不同的配合物，其顏色也有所不同。如：Fe3+與水揚(yáng)酸的配合物：PH＜4 Fe(C7H4O3)+

紫色4＜PH＜9 Fe(C7H4O3)2－ 紅色PH＞9 Fe(C7H4O3)

33－黃色由上可見，酸度對顯色反應(yīng)的影響是很大的，適宜的酸度要由實(shí)驗(yàn)來確定。54（三）顯色時間：顯色反應(yīng)的速度有快有慢，快的幾乎是瞬間完成，顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應(yīng)的速度是比較慢的，需要一定時間才能達(dá)到穩(wěn)定。而且有些有色化合物放置過久也會褪色。適宜的顯色時間要由實(shí)驗(yàn)來確定。55（四）溫度：一般顯色反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，但是也有一些反應(yīng)要加熱到一定溫度下才能進(jìn)行。而且還有一些有色配合物在室溫下要分解。（五）溶劑的影響：1．影響有色化合物的溶解度；2．影響有色化合物的顏色；3．影響顯色反應(yīng)進(jìn)行的速度；56（六）干擾離子的影響和消除方法：

1．與試劑生成有色配合物及大量干擾離子與試劑生成穩(wěn)定的配合物；2．干擾離子本身有色；3．與被測離子形成難離解化合物。57消除干擾的方法主要有以下幾種：1．控制酸度：2．加入掩蔽劑；3．分離干擾離子；4．進(jìn)行同時測定；5．利用氧化還原反應(yīng)改變價態(tài)；6、用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾；7、選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL；8、分離：以上方法均不奏效時，采用預(yù)先分離的方法。58二．測量條件的選擇：1．測量波長的選擇：一般選用待測物質(zhì)的最大吸收波長作為測量波長（入射光）但當(dāng)在最大吸收波長處有干擾時，則應(yīng)根據(jù)“吸收最大干擾最小”的原則來選擇波長。592．控制適當(dāng)?shù)奈舛确秶河蓽y量誤差可知，當(dāng)吸光度在0.2～0.8之間時，測量誤差最小，所以應(yīng)盡量控制吸光度在此范圍進(jìn)行測定。控制的方法為：1）控制溶液的濃度；2）選用適當(dāng)厚度的比色皿；60

3．選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤海篴.如果僅有顯色劑與被測組分反應(yīng)的產(chǎn)物有吸收，則可以用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤?；b.如果顯色劑和其他試劑有顏色，則用試劑溶液作參比液；c.如果顯色劑與試劑中干擾組分反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，則按如下方式配置參比液：(1)吸收較弱時，直接用試劑溶液作參比液；(2)吸收較強(qiáng)時，可選用合適的掩蔽劑將被測組分掩蔽后再加顯色劑和其他試劑，以此配制的溶液作參比液。61§5—5紫外—可見分光光度法的應(yīng)用一．紫外-可見分光光度法在定性分析中的應(yīng)用（一）定性分析：（二）結(jié)構(gòu)分析：62（三）分析方法：

1．比較光譜法，2．制作試樣的吸收曲線并與標(biāo)準(zhǔn)紫外光譜對照；3．利用Woodward-Fieser經(jīng)驗(yàn)規(guī)則求最大吸收波長。631.定性分析(輔助方法)

在相同的條件下測定相近濃度的待測試樣和標(biāo)準(zhǔn)品的溶液的吸收光譜，然后比較二者吸收光譜特征：吸收峰數(shù)目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置等；分子結(jié)構(gòu)相同的化合物應(yīng)有完全相同的吸收光譜。641、Woodward-Fieser規(guī)則計(jì)算共軛二烯、多烯烴及共軛烯酮類化合物躍遷最大吸收波長的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則。共軛二烯、多烯烴:共軛烯酮類化合物:2、Scott規(guī)則類似于Woodward-Fieser規(guī)則，用于計(jì)算芳香族羰基衍生物的躍遷最大吸收波長的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則。65共軛二烯、多烯烴類化合物躍遷最大吸收波長計(jì)算

基值217nm基值253nm66增加一個共軛雙鍵30環(huán)外雙鍵5每個烷基取代5-O-乙?；?-O-R6-S-R30-Cl,-Br5-NR260溶劑校正值067基值253nm環(huán)外雙鍵5nm烷基取代(3×5)15nm273nm

68基值253nm環(huán)外雙鍵5nm烷基取代(4×5)20nm共軛系統(tǒng)延長30nm308nm

692.14有兩種異構(gòu)體，α異構(gòu)體的吸收峰在228nm(ε=14000)，而β異構(gòu)體的吸收峰在296nm(ε=11000)。試指出這兩種異構(gòu)體分別屬于下面兩種結(jié)構(gòu)中的哪一種。(1)(2)70二、結(jié)構(gòu)分析1、判別順反異構(gòu)番茄紅素、偶氮苯反式異構(gòu)體的lmax和emax大2、判別互變異構(gòu)烯醇式——酮式烯醇式的lmax和emax大712），不飽和酮最大吸收位置的計(jì)算值六元環(huán)或非環(huán)，不飽和酮基準(zhǔn)值215nm位移增量（nm）同環(huán)共軛雙鍵39

環(huán)外雙鍵（C=C）5

延伸雙鍵3072共軛體系上取代基α：10；β：12；

γ位或更高位：18

OCORαβγδ：6OHα：35；β：30；γ：50

Clα：15：β：12Brα：25；β：30NR2β：9573

基值

217四個烷基取代4520二個環(huán)外雙鍵2510計(jì)算值(max)247nm實(shí)測值(max)247nm74三、定量分析半定量：比色法75定量分析方法的依據(jù)是Lambert-Beer定律（一）單組分定量1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列（5~10）個不同c的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在適當(dāng)

(通常為max)下，以適當(dāng)?shù)目瞻兹芤鹤鲄⒈?，分別測定A，然后作A-c

曲線同條件下測定試樣溶液吸光度Ax，查找對應(yīng)的cx

。2.直接比較法：已知試樣溶液基本組成，配制相同基體、相近濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定吸光度A標(biāo)、A樣

76（二）多組分定量吸光度具有加合性的特點(diǎn)?；旌辖M分的吸收光譜相互重疊的情況不同，測定方法也不相同，常見混合組分吸收光譜相干擾情況有以下三種：

771.第一種情況：各種吸光物質(zhì)吸收曲線不相互重疊或很少重疊，則可分別在1及2處測定a

及

b組分的c；2.第二種情況：部分重疊，先在1

處測得

ca，再在2處測得混合組分的吸光度Aa+b

，根據(jù)吸收定律加和性：

Aa+b(2)

=Aa(2)

+Ab(2)

=a(2)

·b·ca+b(2)

·b·

cb應(yīng)先求得a(2)與b(2)

，并使用相同b,即可求得cb。3.第三種情況：兩吸收曲線互相重疊78如何提高分光光度法的檢測極限？A=ebc

或c=A/eb，欲使待測組分濃度c盡可能小，決定于以下因素①可準(zhǔn)確測量的吸光度A值愈小:這始終是儀器制造商追求的目標(biāo)，目前，高精度分光光度計(jì)可準(zhǔn)確測量到0.0001吸收單位。②增大吸收池光程:用1～4m全反射長光路毛細(xì)吸收管用于天然水中超痕量磷，可測至0.1ppt級。③增大有色化合物的e:目前，有不少二元或三元配合物的顯色反應(yīng)生成的有色絡(luò)合物的e為105級,少數(shù)達(dá)106級?？梢怨浪愠龀Ｒ?guī)分光光度法的極限測定濃度:

假定可準(zhǔn)確測量的A=0.0001,采用5cm的比色皿