第一章基因工程的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)

2014-2015第一章基因工程的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)基因和信息流一、基因的概念基因：遺傳信息的基本單位，位于染色體或基因組中特定位置的一段DNA或RNA序列，可編碼有特定功能的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物。含有編碼序列（外顯子）、非編碼區(qū)（內(nèi)含子）、5’端的前導(dǎo)序列、3’端的尾隨序列、一些表達(dá)調(diào)控元件（原核基因的弱化子、終止子、真核基因的加A信號）等。2真核基因的結(jié)構(gòu)3等位基因（allele）：指一個基因突變而產(chǎn)生的多種形式之一。在二倍體真核生物中，等位基因成對存在于一對同源染色體的特定基因座上。在原核生物中，等位基因單獨(dú)存在于染色體上或染色體外（如質(zhì)粒上）。重疊基因的存在表明原核基因的編碼是可以重復(fù)的，可節(jié)省堿基資源，以有限的核酸序列編碼更多的信息。斷裂基因的證實(shí)顯示真核基因多為不連續(xù)的編碼。4二、遺傳的中心法則基因表達(dá)：指DNA分子經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生與之互補(bǔ)的RNA分子。5細(xì)胞分裂依賴于DNA的復(fù)制從而使染色體復(fù)制。兩條互補(bǔ)的反向平行的DNA單鏈之間由眾多氫鍵的連接，從而形成穩(wěn)定的DNA雙鏈分子。DNA合成的起始需要引物提供3’羥基，DNA聚合酶按照5’3’方向合成DNA。（一）DNA合成6也稱為DNA的轉(zhuǎn)錄，需要RNA聚合酶的催化，以單鏈DNA為模板合成一條互補(bǔ)的RNA序列，將遺傳信息從DNA傳遞到RNA。與DNA合成的區(qū)別：a.轉(zhuǎn)錄時只有一條DNA鏈模板，復(fù)制時兩條鏈都作為模板。b.DNA-RNA雜合雙鏈不穩(wěn)定，RNA合成后釋放；DNA復(fù)制，新鏈和母鏈結(jié)合形成子鏈。c.RNA合成不需引物，DNA復(fù)制需要引物；d.轉(zhuǎn)錄的底物是rRNA，復(fù)制的底物是dNTP；e.所用的聚合酶系不同。（二）RNA合成(三)蛋白質(zhì)合成7

蛋白質(zhì)合成涉及細(xì)胞中的翻譯裝置——核糖體，由大量的rRNA和核糖體蛋白組成的。DNA基因序列忠實(shí)地轉(zhuǎn)錄成mRNA，其三聯(lián)密碼子含有蛋白質(zhì)合成的信息，稱為遺傳密碼。共64個密碼子，其中61個有義密碼子編碼20個氨基酸，3個無義密碼子作為翻譯的終止密碼子（UGA），61個有義密碼子中有一個是翻譯的起始密碼子（AUG），它編碼甲硫氨酸。8核糖體結(jié)合到mRNA的5’端，開始蛋白質(zhì)的合成。第一個氨基酸通常為甲硫氨酸。核糖體以

5’3’的方向閱讀密碼子結(jié)束mRNA，直到終止密碼子結(jié)束。在任何DNA序列中，理論上一個蛋白質(zhì)或一個多肽的連續(xù)的密碼子系列稱為可讀框。三、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)——操縱子模型9乳糖操縱子：6000bp操縱基因O3個結(jié)構(gòu)基因：lacZ、lacY和lacA。乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的決定因素：阻遏蛋白E.ColilacIq突變：lac阻遏蛋白基因超表達(dá)，使阻遏蛋白水平大大提高，結(jié)果高度阻遏了操縱子。lac啟動子突變（如lacUV5啟動子突變）：雖然這類突變不改變操縱子的阻遏，但增加了啟動子的活性。用IPTG誘導(dǎo)這兩種突變的菌株，其表達(dá)可超過野生型菌株100倍。11藍(lán)白斑篩選β-半乳糖苷酶的活性可作為基因活性的指標(biāo)?？墒拱l(fā)色底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。lacZ′基因是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含此基因的重組載體轉(zhuǎn)化lacZ′互補(bǔ)型菌株，可轉(zhuǎn)譯β-半乳糖苷酶，在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上可使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落。12一、核酸大分子的結(jié)構(gòu)第二節(jié)核酸的生物化學(xué)生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖，其中核酸、蛋白質(zhì)是機(jī)體的兩類最基本的生物大分子，它們都屬于信息分子。DNA遺傳信息的載體、mRNA遺傳信息傳遞的中介物、蛋白質(zhì)

遺傳信息表達(dá)的終產(chǎn)物。二、DNA雙螺旋的變性與復(fù)性變性：指在一定條件下（高溫或變性劑等）DNA雙螺旋解鏈的過程。解鏈溫度：在DNA變性進(jìn)行到一半時的溫度。對260nm紫外光的吸收率——光密度值（OD），可用來檢測溶液中DNA單鏈或雙鏈的濃度。復(fù)性：指DNA分子由單鏈狀態(tài)恢復(fù)到雙鏈結(jié)構(gòu)的過程，又稱退火。變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核 酸分子鏈間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。變性后的理化性質(zhì)變化：

粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈

階梯式曲線GC含量與Tm值之間的關(guān)系

（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44

Tm=(G+C)%×0.41+69.3復(fù)性過程①單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈②局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離③局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列④形成完整的雙鏈分子參數(shù)對Tm的影響對復(fù)性速率的影響堿基的成分Tm值隨G-C含量的增加而增加無序列的長度Tm值隨序列長度的增加而增加，當(dāng)>500bp時，Tm值不受影響隨序列長度的增加而上升離子濃度Tm值隨Na+濃度的增加而增加最理想的Na+濃度為1.5M堿基錯配比例最理想的值隨堿基錯配比例（%）的增加而下降隨堿基錯配比例而下降DNA濃度不影響Tm值隨Na+濃度的增加而增加變性劑Tm值隨甲酰胺和尿素濃度的增加而減少最理想的甲酰胺濃度為50%溫度不適用最理想的溫度是低于Tm20℃各種影響DNA變性和復(fù)性的因素第三節(jié)分子雜交分子雜交：又稱為核酸分子雜交，是用一條單鏈DNA或RNA與另一被測單鏈DNA形成互補(bǔ)雙鏈分子的過程，以測定某特異序列是否存在。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交都必須有探針的存在。就是用同位素或非同位素，如熒光染料、生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA序列。一、原位分子雜交分兩種：玻片原位雜交和膜上原位雜交。玻片原位雜交：要先制片，如中期染色體片和組織切片等。片子制好后不染色，放在緩沖液中慢慢變性，再加入探針讓其復(fù)性，將沒有結(jié)合的探針充分洗脫。若用同位素標(biāo)記探針，須在片子涂一層乳膠或覆蓋一張同樣大小的X光片進(jìn)行放射自顯影，再觀察同位素的曝光點(diǎn)在組織細(xì)胞或染色體上的相對位置。若用熒光標(biāo)記，可用熒光顯微鏡直接觀察。此方法用來進(jìn)行染色體的基本定位或觀察組織中不同的RNA分布。膜上原位雜交：將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上，這種膜只吸附單鏈DNA，將影印好的膜用NaOH處理，不僅可殺死細(xì)菌，還可使DNA變性吸附在膜上，再用無關(guān)的單鏈DNA，如小牛胸腺DNA和鮭魚精子DNA吸附在膜上的空白處，稱為預(yù)雜交（防止探針被吸附在背景上，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果），膜經(jīng)中和后再將同位素探針和膜放在緩沖溶液中緩緩復(fù)性，經(jīng)放射自顯影來確定陽性菌落。常用于從基因文庫中釣基因。*22熒光上原位雜交（FISH）：用熒光標(biāo)記的核酸探針在中期染色體上進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下觀察，以確定與探針互補(bǔ)的核酸序列在染色體的位置和分布。常用作基因定位、基因診斷等。一種FISH的擴(kuò)展是染色體涂染，來自特異染色體或染色體區(qū)域的一套已知克隆DNA用不同的熒光染料標(biāo)記，這些染料使特異區(qū)域著色，這樣在熒光顯微鏡下易于鑒別。如一個尚未定位的基因克隆用不同的染料標(biāo)記，那么它的位置在一系列不同的染色帶中被鑒別出。23二、芯片技術(shù)DNA芯片，也稱基因芯片或微陣列，是利用反相雜交原理，使用固定化的探針陳列與樣品雜交，通過熒光掃描和計算機(jī)分析，獲得樣品中大量基因及表達(dá)信息的一種高通量生物信息分析技術(shù)。24三、印跡雜交（一）DNA印跡即Southern雜交，1975年由英國人埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）創(chuàng)建。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析、基因突變分析、特性基因定性和定量及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。1、待測核酸樣品的制備

1）裂解或破碎細(xì)胞

2）抽取純化基因組DNA 3）限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段2、待測DNA樣品的電泳分離

1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠

2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動慢,小分子DNA泳動快， 大小相同的分子處于同一條帶

3）分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記263、凝膠中核酸的變性(堿變性)凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性為單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。使用稀HCl使DNA脫嘌呤，這樣可以讓DNA片段變短，提高轉(zhuǎn)移效率。4、Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。271）固相支持物的選擇a.理想的固相支持物應(yīng)具備的特性： ①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 ②不影響與探針的雜交反應(yīng) ③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 ④具有良好的機(jī)械性能 ⑤非特異吸附少b.常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號本 底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低2）Southern印跡的常用方法a.毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中 的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上?；驹恚?/p>

容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。55b.電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。c.真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾 膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。5、Southern雜交

1）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交，緩沖液為不含DNA探針的雜交液。

2）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

3）洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA。6、雜交結(jié)果檢測1）放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針。2）比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針。（二）RNA印跡（Northern印跡雜交）

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、對待檢樣品中mRNA的長度和豐度進(jìn)行分析

3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測樣品為總RNA或mRNA

RNA印跡可以測定某基因表達(dá)的時空特異性。37Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性。前者采用的變性劑是甲醛或聚乙二醇，后者只是采用NaOH。

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理。

3、靶核酸為RNA。（三）蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）

1、用來檢測蛋白質(zhì)而不是檢測核酸。

2、不用毛細(xì)管原理，而是通過電場的作用將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)電泳帶轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以親和反應(yīng)或免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)測定蛋白質(zhì)的技術(shù)。 （四）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交

1、斑點(diǎn)印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量40東方印跡（Easternblotting）用來檢測真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)。檢測目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基因或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等。利用雙向電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)到膜上，再用特定探針去檢測。西南方印跡（Southwesternblotting）結(jié)合蛋白質(zhì)印跡和DNA印跡的特點(diǎn)，用于檢測序列特異性DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合。首先用SDS的方法將蛋白質(zhì)分離開并轉(zhuǎn)移到膜上，在尿素的存在下去除SDS，使蛋白質(zhì)復(fù)性，最后用放射性雙鏈DNA探針與吸印在硝酸纖維素膜的核提取蛋白結(jié)合，來鑒別DNA結(jié)合蛋白。用于檢測蛋白的分子質(zhì)量。（五）其他印跡41四、異源雙鏈定位法和R環(huán)定位法異源雙鏈定位法：將異源DNA雙鏈變性后進(jìn)行分子雜交，然后在電鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)有環(huán)形不配對的部分，表明可能存在缺失。R環(huán)定位法：將標(biāo)記的mRNA和變性后的待測雙鏈DNA進(jìn)行雜交，制片后，可以以觀察到R環(huán)，這是由于RNA和DNA形成的雙鏈比原來的DNA雙鏈更為穩(wěn)定，將一條DNA單鏈置換了出來，表明這些釋放出的環(huán)狀單鏈DNA部分是內(nèi)含子。主要用來進(jìn)行基因定位、內(nèi)含子的探測及DNA缺失的確定等。42第四節(jié)基因工程中常采用的酶類限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類—用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化檢測等。一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶和激酶三、DNA聚合酶和RNA聚合酶一、限制性核酸內(nèi)切酶DNA體外重組，首先必須獲得需要重組和能夠重組的DNA片段用限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA分子是獲得這種DNA片段的主要途徑。限制性內(nèi)切酶－基因的剪刀（一）限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease）概念是一類能識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切斷雙鏈DNA磷酸二酯鍵的核酸水解酶。按其性質(zhì)可分為3大類。Ⅰ型有特定的識別順序，但是切點(diǎn)與之有一定距離。反應(yīng)要求有ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α、β和γ亞基組成。全酶兼有限制性內(nèi)切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅲ型與Ⅰ型有相似特征，只是切點(diǎn)距識別順序距離是嚴(yán)格的。Ⅱ型酶，獨(dú)立的限制性核酸內(nèi)切酶，不兼有甲基化酶的活性，切點(diǎn)在識別順序中。Ⅱ型的酶只有單一的亞基，以二體或四體發(fā)揮作用。上述3個酶系統(tǒng)中，只有II型限制酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。如果沒有專門說明，通常所說的限制性內(nèi)切是Ⅱ型酶。限制性內(nèi)切核酸酶一般以酶源生物的屬名和種名前1、2個字母以及株（型）代號來命名。如果從同一種生物中先后提取到多種限制性內(nèi)切核酸酶，則依次用羅馬數(shù)字表示。例如，從HaemophilusinfiuenzaeRd中提取到的第3種限制性內(nèi)切核酸酶被命名為HindⅢ（前三個字母必須是斜體）。（二）限制性內(nèi)切核酸酶特點(diǎn)1.識別順序和酶切位點(diǎn)限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈DNA上能夠識別的核苷酸序列被稱為識別序列。1）多數(shù)識別４-8個相連的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；2）富含GC3）對稱性—雙對稱這些酶的識別順序大都具有180°旋轉(zhuǎn)對稱的特征。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’4）切點(diǎn)大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點(diǎn)，可用↓表示。限制性內(nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點(diǎn)一般是在識別序列內(nèi)部，如：C↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓CC、AGCGC↓T等。少數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶在DNA上的酶切位點(diǎn)在識別序列的兩側(cè)，如：↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等。5）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH2.

末端種類有時切口可帶有一個短的單鏈末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。這種短的單鏈末端，稱為“粘性末端”，它與對應(yīng)的單鏈末端很容易恢復(fù)原來的堿基配對，而粘接成雙鏈。

1）3’-端突起，個數(shù)為2或4個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

2）5’-端突起，個數(shù)為2或4個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’3）

平齊末端切口有時是平頭的，即雙鏈的切點(diǎn)位置相同，如AluⅠ和HaeⅢ等。

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

4）非互補(bǔ)的粘性末端

a）切點(diǎn)在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

b）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG；CTCGGG；CCCGAG；CTCGAG

酶切位點(diǎn)在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNNN-5’FokI37℃5’-GGATGNNNNNNNNN-OH3’3’-CCTACNNNNNNNNNNNNNN-P5’5）相容性末端有些限制性內(nèi)切核酸酶雖然識別序列不同，但是酶切DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有相同的黏性末端，稱這樣的一組限制性內(nèi)切核酸酶為同尾酶（isocaudarner）。

如TaqI，ClaI和AccI為一組同尾酶，其中任何一種酶酶切DNA分子，均產(chǎn)生5’-CG黏性末端。同尾酶在基因重組操作中有特殊的用途。當(dāng)把同尾酶切割的DNA片斷與原來的限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段連接后，原來的酶切位點(diǎn)將不存在。有的限制性內(nèi)切核酸酶可識別2種以上的核苷酸序列。如AccⅠ即可識別GTATAC，又可識別GTCGAC；DdeI可識別的核苷酸序列有CTAAG、CTTAG、CTGAG和CTCAG共4種。另有一些限制性內(nèi)切核酸酶雖然來源不同，但是具有相同的識別序列。這樣的限制性內(nèi)切核酸酶被稱為同裂酶（isoschizomer），如BamHI和BstI為同裂酶，識別序列GGATCC。同裂酶可以具有不同的酶切位點(diǎn)（2種不同的限制性內(nèi)切核酸酶），也可以具有相同的酶切位點(diǎn)（往往是從不同生物中提取到的同一種限制性內(nèi)切核酸酶）。（三）限制酶的星反應(yīng)（staractivity）特點(diǎn)：限制酶識別序列特異性降低具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,71.亞乙二醇(45%)；2.甘油(12%)；3.乙醇(12%)；4.高酶/DNA比(>25U/μg)；5.Mn++代替Mg++；6.pH8.5；7.二甲基亞砜(8%)；8.無NaCl。（四）其它特異性的內(nèi)切酶1.λ末端酶（λterminase）：

識別結(jié)合特異性地切割λDNA的cos序列。

5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出現(xiàn)的頻率約412

2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418，其識別順序?yàn)?’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT3.I-PpoI：來自于Physarumpolycephalum

識別序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT（五）限制性內(nèi)切核酸酶酶切1.反應(yīng)系統(tǒng)限制性內(nèi)切核酸酶同其他酶類一樣，反應(yīng)系統(tǒng)除酶本身外，還應(yīng)包括反應(yīng)底物和反應(yīng)緩沖液，并且還需要合適的反應(yīng)溫度。限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)底物是環(huán)狀的或線形的雙鏈DNA分子（或DNA片段）。廠家提供某種限制性內(nèi)切核酸酶時一般同時提供一種相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液。大多數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶的最適反應(yīng)溫度是37℃。2.酶切方法常用的酶切方法有單酶切、雙酶切和部分酶切等幾種。（1）單酶切法這是用一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA樣品。若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)生與識別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同。若DNA樣品本來就是線形DNA片段，完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生n+1個DNA片段數(shù)，其中有2個片段的一端仍保留原來的末端。（2）雙酶切法這是用2種不同的限制性內(nèi)切核酸酶酶切同一種DNA分子的方法。

考慮緩沖液DNA分子無論是環(huán)狀DNA分子，還是線形DNA片段，酶切結(jié)果，DNA片段的2個黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。環(huán)狀DNA分子完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)是兩種限制性內(nèi)切核酸酶識別序列數(shù)之和。線形DNA片段完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)是兩種限制性內(nèi)切核酸酶識別序列數(shù)之和加1。（3）部分酶切指選用的限制性內(nèi)切核酸酶對其在DNA分子上的全部識別序列進(jìn)行不完全的酶切。導(dǎo)致部分酶切的原因底物DNA的純度低、識別序列的甲基化、酶用量不足、反應(yīng)時間不夠以及反應(yīng)緩沖液和溫度不適宜等。部分酶切會影響需要的DNA片段的得率。但是從另一方面說，有時根據(jù)重組DNA的需要，還專門創(chuàng)造部分酶切的條件，以獲得需要的DNA片段。AB標(biāo)示反了？BA（六）限制酶的用途

1、DNA重組

2、限制酶（物理）圖譜繪制3、突變分析（RFLP分析）4、限制酶的部分酶切與完全酶切二、DNA連接酶和激酶基因工程的實(shí)質(zhì)是基因重組?；蛑阅軌蛟谠嚬軆?nèi)進(jìn)行重組，是因?yàn)镈NA片段在DNA連接酶作用下能夠進(jìn)行連接，組成重組DNA分子。1.DNA連接酶（DNAligase）概念能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’-OH末端與5’-磷酸末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于試管中連接DNA片段的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coli

DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，而T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。2.DNA片段之間的連接（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接連接反應(yīng)可用E.coliDNA連接酶，也可用T4DNA連接酶。待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保留原限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果是用2種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生相同的互補(bǔ)黏性末端，可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來用于酶切的那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。（2）具平末端DNA片段之間的連接連接反應(yīng)必須用T4DNA連接酶（圖b）。如果用2種不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切產(chǎn)生的平末端DNA片段之間進(jìn)行連接后的DNA分子失去那2種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果2個DNA片段的末端是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切后產(chǎn)生的，連接后的DNA分子仍保留那種酶的識別序列，有的還出現(xiàn)另一種新的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列。（3）DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接

待連接的兩個DNA片段經(jīng)過不同限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，產(chǎn)生的末端未必是互補(bǔ)黏性末端，或者未必都是平末端，因此無法進(jìn)行連接,在這種情況下，連接之前必須對兩個末端或一個末端進(jìn)行修飾。修飾的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（ExoⅦ）將黏性末端修飾成平末端；采用末端轉(zhuǎn)移酶將平末端修飾成互補(bǔ)黏性末端；有時為了避免待連接的兩個DNA片段自行連接成環(huán)形DNA，或二聚體、多聚體，可采用堿性磷酸酯酶將其中一種DNA片段5’末端的一P修飾成一OH。（4）DNA片段加銜接頭后連接如果要連接既不具互補(bǔ)黏性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了上述用修飾一種或兩種DNA片段末端后進(jìn)行連接的方法外，還可以采用人工合成的銜接頭。先將銜接頭連接到待連接的1種或2種DNA片段的末端，然后用合適的限制性內(nèi)切核酸酶酶切銜接頭，使待連接的兩種DNA片段具互補(bǔ)黏性末端，最后在DNA連接酶催化下使兩種DNA片段連接，產(chǎn)生重組DNA分子。此外，也可以根據(jù)兩DNA片段的末端，選用合適的銜接頭直接把兩DNA片段連接在一起。3、激酶

通過催化ATP的γ-磷酸基共價附著在靶分子上，磷酸化特異的底物。T4噬菌體多核苷酸激酶是一種磷酸化DNA或RNA5’羥基的酶。用于[γ-32P]ATP標(biāo)記DNA5’端，也可對缺乏5’-磷酸的DNA或人工接頭進(jìn)行磷酸化。

細(xì)菌的堿性磷酸酯酶是一種去除DNA5’-磷酸的酶。用于T4噬菌體多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記前除去5’-磷酸，或用來處理經(jīng)切過的載體DNA，防止其重新環(huán)化而降低轉(zhuǎn)化效率。T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)2009-11-2666三、DNA聚合酶和RNA聚合酶以單鏈DNA作為模板，DNA聚合酶和RNA聚合酶可直接合成互補(bǔ)的核酸。DNA合成時需要具有3’羥基的DNA或RNA作為引物，而RNA可起始從頭合成。RNA聚合酶是催化RNA合成的酶。DNA聚合酶的特性PCR反應(yīng)時，需要用耐高溫的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，其在75℃具有最佳活性，對95℃高溫具有良好的穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）基本用途

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)T4DNA酶的基本特性：有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合 酶活性。在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切－在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸。－在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。基本用途2009-11-2655基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNA

DNA連接酶

DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段

反轉(zhuǎn)錄酶 多聚核苷酸激酶 末端轉(zhuǎn)移酶 堿性磷酸酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接①合成雙鏈cDNA分子或片段連接②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補(bǔ)3′末端又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚合、3′→5′外切活性，而無5′→3′外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3′末端標(biāo)記等①合成cDNA②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基83測序酶：經(jīng)修飾后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在體外反應(yīng)中用含有雙脫氧的核苷進(jìn)行鏈的終止。反轉(zhuǎn)錄酶：用來產(chǎn)生互補(bǔ)DNA（cDNA）；用于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可進(jìn)行放射標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶：反應(yīng)特點(diǎn)：底物：dNTP及衍生物，>3個核苷酸，要求3’-OH 端，需要單鏈DNA作為引物，以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾。用于3’-加尾，便于兩DNA分子重組;3’-末端標(biāo)記84測序酶：經(jīng)修飾后消除了3’5’外切酶活性的T7DNA聚合酶。

在體外反應(yīng)中用含有雙脫氧的核苷進(jìn)行鏈的終止。反轉(zhuǎn)錄酶：用來產(chǎn)生互補(bǔ)DNA（cDNA）；用于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可進(jìn)行放射標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶：反應(yīng)特點(diǎn)：底物：dNTP及衍生物，>3個核苷酸，要求3’-OH 端，需要單鏈DNA作為引物，以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾。用于3’-加尾，便于兩DNA分子重組;3’-末端標(biāo)記85第五節(jié)研究DNA和RNA的方法一、核酸的分離純化分離提取的核酸樣品，分為DNA和RNA，由于不同的實(shí)驗(yàn)要求，需用不同的方法進(jìn)一步純化，核酸純化的主要目標(biāo)是去除其中的蛋白、多糖、多酚、鹽離子等雜質(zhì)。核酸的純化、濃縮、

沉淀、定量、保存。（一）核酸的純化DNA作為核酸內(nèi)切酶的底物，應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有酚、氯仿、乙醚、大于l0mmol/L的EDTA、去污劑（如SDS）以及過量的鹽離子濃度，這些因素的存在均可不同程度地影響限制性內(nèi)切酶的活性。核酸純化的方法很多，不同的方法對應(yīng)于不同的研究目的。酚/氯仿抽提、超速離心、柱層析、分子雜交、免疫沉淀、凝膠電泳等方法。在此僅介紹從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的酚/氯仿抽提法。這個方法的標(biāo)準(zhǔn)程序是酚/氯仿（1:1）抽提1次，氯仿抽提1-2次，如果情況需要可再重復(fù)幾次。1、酚/氯仿抽提法的基本原理混合使用酚、氯仿（蛋白質(zhì)變性劑），以增加去除蛋白雜質(zhì)的效果。因?yàn)榉与m可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶的活性；而且酚能溶解10％-15％的水，從而能溶解一部分核酸，同時氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生氣泡。最后用氯仿抽提處理，是為了去除核酸溶液中的痕量酚。如果所提核酸的酶反應(yīng)條件要求極嚴(yán)格，最可靠的方法是再用水飽和的乙醚抽提一次，以徹底去除核酸樣品中的痕量酚與氯仿，然后在68℃水浴中放置10分鐘，使痕量乙醚蒸發(fā)掉。2.酚/氯仿抽提法的基本步驟如果DNA或RNA體積較小，一般于1.5ml的Eppendorf離心管中進(jìn)行，若體積較大則于10-50ml的離心管中進(jìn)行。1）在每一樣品中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）溶液。2）若DNA片段小于l0kb，可以振蕩混合；

大于l0kb，則反復(fù)輕柔地轉(zhuǎn)動離心管，形成乳狀液。（切勿使用高速的振蕩器）3）室溫下，于10000×g以上

（一般要10000-12000rpm以上）離心l0分鐘。4）吸取上層水相于一個新的離心管中。如果DNA的分子量較大，可將槍頭的尖端剪去一截，以增大槍頭口的直徑。吸取速度要慢而勻，這樣既減少吸液時的機(jī)械剪切，又可盡量避免吸取界面處的蛋白雜質(zhì)層。5）加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）溶液，重復(fù)步驟(2)、(3)、(4)。6）向核酸溶液中加入等體積的水飽和乙醚，混勻，靜止2-5分鐘，分層，含核酸樣品的水相在下層（乙醚高度揮發(fā)、易燃，應(yīng)在通風(fēng)廚中工作）。7）移棄上層乙醚。8）將核酸溶液于68℃水浴5-10分鐘，不時用手指彈動管壁，使乙醚蒸發(fā)。

（第6-8步一般不用）9）乙醇沉淀核酸。3.酚/氯仿抽提法的注意事項1）必須采用Tris緩沖液平衡后的重蒸酚，pH必須在8.0，中性尤其是酸性酚，在核酸沉淀中會導(dǎo)致DNA沉淀而隨雜質(zhì)一塊丟失。2）該法只能去除核酸中的蛋白雜質(zhì)，而多酚、多糖等雜質(zhì)則很難除去。3）如果對DNA去蛋白效果要求更高，可以在酚/氯仿/異戊醇抽提后又重復(fù)1次抽提。4）如果要求非常徹底地去除產(chǎn)物中的痕量酚，可以在氯仿/異戊醇抽提后又重復(fù)一次抽提。5）常規(guī)實(shí)驗(yàn)中一般對痕量殘存氯仿的去除效果要求不太高，可以省略乙醚抽提過程，氯仿/異戊醇抽提后直接用乙醇沉淀。6）根據(jù)DNA片斷長度及研究目的而選擇合適的混勻方式和力度很重要，總的原則是讓酚/氯仿/異戊醇，或氯仿/異戊醇與核酸水相混勻成乳狀液并保持10分鐘左右才能達(dá)到去蛋白的效果。7）若是大分子量DNA可以將樣品在預(yù)冷的STE（pH7.8）中充分透析，以減少對大分子量核酸的機(jī)械損傷。8）乙醚在室溫下應(yīng)保存在通風(fēng)櫥中或試劑架上。千萬不能放入冰箱（冰箱自動化霜后起動打火，揮發(fā)的乙醚發(fā)生爆炸）。9）在酚中加入0.1%8-羥基喹啉可以延長保存時間和提高純化效果。（二）核酸的濃縮一般情況下抽提的核酸液在去除雜質(zhì)后，可直接進(jìn)行沉淀，而無需進(jìn)行核酸的濃縮。但若溶液中DNA含量低，并且體積較大，不易進(jìn)行乙醇沉淀，可以采用以下2種方法，減少溶液體積并濃縮核酸。1.固體聚乙二醇（PEG）吸水濃縮法1）將DNA溶液裝入透析袋，透析完畢后，置于一平皿中。2）加人適量PEG（分子量6000-12000）包埋透析袋。3）待PEG吸濕（大約10分鐘）后，再換新的PEG顆粒包圍透析袋，

重復(fù)步驟（2）、（3），直到體積合適。4）用TE懸浮透析袋，漂洗凈表面的PEG。5）取出透析袋中的DNA溶液，分裝貯存?zhèn)溆茫?/p>

或再用乙醇沉淀回收DNA。2.丁醇抽提濃縮法正丁醇或仲丁醇抽提水溶液時，可將溶液中的水吸入有機(jī)相，而溶液中的溶質(zhì)（DNA）則不會分配到正丁醇中去。利用該特性，可以顯著減少DNA溶液的體積。1）在DNA溶液中，加入等體積丁醇，充分混合，（加入過多的丁醇會使溶液中的水迅速丟失，而導(dǎo)致DNA沉淀）2）以1600×g離心1分鐘，棄上層有機(jī)相。3）重復(fù)步驟(1)、(2)，以達(dá)到所需體積。4）用水飽和乙醚抽提2次，可去除痕量丁醇，然后在68℃條件下，蒸發(fā)去除痕量乙醚。丁醇抽提，并不能去除溶液中鹽類，抽提后可利用乙醇沉淀回收DNA。（三）核酸的沉淀1.有機(jī)沉淀劑乙醇等有機(jī)溶劑能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來。Na+等離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解。優(yōu)點(diǎn)通過核酸沉淀來改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)節(jié)核酸在溶液中的濃度；可去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)，在一定程度上純化核酸。1）乙醇沉淀DNA乙醇是首選的有機(jī)溶劑，它對鹽類沉淀少，DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸發(fā)去除，不影響以后的實(shí)驗(yàn)。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，2倍樣品體積的無水乙醇可有效沉淀DNA，

對于RNA則需要將乙醇量增至2.5倍樣品體積。2）異丙醇

0.5-1.0倍樣品體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，對5SrRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀。優(yōu)點(diǎn)：所需體積小且速度快，適用于濃度低、而體積大DNA樣品的沉淀。缺點(diǎn)：易使鹽類（如NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；DNA沉淀中的異丙醇難以除去（可用70％的乙醇漂洗DNA沉淀）。3）聚乙二醇可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同分子量的DNA片段。應(yīng)用6000分子量的PEG進(jìn)行沉淀時，其使用濃度與DNA片段的大小成反比。除去DNA沉淀中PEG最簡便有效的辦法是用70％的酒精漂洗2次。4）精胺使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)，與DNA分開。要求在溶液中無鹽或低鹽（小于0.1mol/L）。用70％的乙醇漂洗沉淀或透析，可去除DNA沉淀中的痕量精胺。2.鹽類大多數(shù)金屬鹽都能在短時間內(nèi)與核酸形成沉淀。使用最多的是1價陽離子，包括鈉、鉀、銨和鋰等離子，但2價鎂離子的沉淀效力最高。醋酸鈉（NaAc）為沉淀核酸的最常用的鹽類，終濃度為0.3mol/L（pH5.2）。醋酸鉀（KAc）使用濃度、沉淀效果與NaAc相同，但核酸的鉀鹽形式很難溶于含SDS（十二烷基硫酸鈉）的溶液。氯化鋰（LiCl）0.8mol/L終濃度的LiCl不與DNA共沉淀，但可直接沉淀大分子量的RNA，故常應(yīng)用于RNA的沉淀。氯化鈉對于含SDS的DNA，最好用NaCl沉淀，終濃度為0.2mol/L；SDS在70％的乙醇中保持溶解狀態(tài)，在乙醇漂洗時除去。醋酸銨dNTP在醋酸銨鹽溶液中具有較高的溶解度，乙醇沉沉DNA中，加入一定濃度的醋酸銨，可去除大部分dNTP。（銨鹽是T4噬菌體多核苷酸激酶的抑制劑）氯化鎂Mg2+是核酸沉淀中的有效離子，當(dāng)核酸濃度低于0.1μmo1或長度小于100個核苷酸時，加入Mg2+可明顯提高核酸的沉淀效率，（鎂離子對DNA降解有促進(jìn)作用，且不利于大分子量的DNA的溶解）3.核酸沉淀的溫度與時間在一般條件下的DNA沉淀，使用0℃冰水、10-15分鐘足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。4.離心力與離心時間多數(shù)DNA沉淀在4℃、12000×g、離心10分鐘即可，濃度低于20ng/ml的的DNA沉淀，上述離心條件也可完成。如DNA片段小于100個核苷酸時，則需要超速離心。對于pg水平的核酸沉淀，則應(yīng)加入tRNA作為載體進(jìn)行共沉淀。超速離心每分鐘60,000轉(zhuǎn)以上5.核酸沉淀的操作方法（1）乙醇沉淀DNA（7步）1）在DNA溶液中加入1/10容積的醋酸鈉，終濃度為0.3mol/L，混勻溶液，對于大片段DNA不能振蕩，應(yīng)輕輕反復(fù)翻動離心管混勻。2）加入2倍體積的冰冷無水乙醇，

混勻后置于冰上15-30分鐘，讓DNA沉淀。3）4℃、12000×g、離心10分鐘，使DNA沉于管底。

當(dāng)樣品濃度小于20ng/ml或DNA片段小于100bp時，需加大離心力和延長離心時間。4）45度角斜拿離心管，用移液槍從沉淀的對面緊貼管壁處輕輕吸出乙醇。5）加入70％的乙醇至管2/3體積，混勻漂洗以去除殘余的鹽，4℃、12000×g、離心2分鐘，吸去乙醇。重復(fù)該步驟漂洗一次。6）敞蓋于室溫中10-15分鐘干燥DNA至沒有明顯乙醇痕跡且DNA沉淀塊大部分變?yōu)榘胪该鳡睢?）用適當(dāng)體積的TE（pH8.0）或10mmol/L的Tris-Cl溶液溶解DNA沉淀，

37℃-65℃水浴有助于DNA溶解。

DNA一般不溶解在純水中，因?yàn)槿菀讛嗔选＃?）乙醇沉淀RNA在終濃度為0.8mol/L的LiCl

或0.3mol/L的NaAc或5mol/L的NH4Ac存在的條件下，加入2.5-3.0倍容積的無水乙醇可沉淀RNA，但加入RNA溶液中的鹽溶液和乙醇必須無RNase，操作時要防止RNase污染。（四）核酸的定量1.比色法測定核酸濃度1）基本原理組成核酸的4種堿基均具有一定的吸收紫外線特性，由多種核苷酸組成的核酸的最大吸收波長260nm，吸收低谷在230nm，該特性可用來測定核酸溶液濃度。在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml，

單鏈DNA或RNA為40μg/ml，

單鏈寡聚核苷酸為20-40μg/ml，可以此來計算核酸樣品的濃度。分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可初步分析核酸的純度。測定260nm和280nm紫外線處吸收值的比值（A260/A280）純品DNA的A260/A280值為1.8，純品RNA的A260/A280值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明DNA中的RNA未除盡。酚和蛋白質(zhì)污染將導(dǎo)致比值降低，270nm處有高吸收表明有酚的干擾。既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值也可能為1.8。751分光光度計2）操作步驟a.吸取一定體積DNA樣品或RNA樣品，

加水稀釋一定倍數(shù)（一般為20-1000倍），

轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b.用水校正分光光度計的零點(diǎn)（空白）。c.在260nm和280nm處分別讀取并記錄光密度的OD值。d.計算核酸濃度并判斷質(zhì)量。

雙鏈DNA的濃度=OD260×50×核酸稀釋倍數(shù)；RNA或單鏈DNA的濃度=OD260×40×核酸稀釋倍數(shù)；機(jī)器合成的短鏈PCR引物的濃度=OD260×33×核酸稀釋倍數(shù)。（單位：μg/ml）2.凝膠電泳法測定核酸濃度1）基本原理DNA、RNA本身不產(chǎn)生熒光，熒光染料溴乙錠（EB）插入堿基平面后，核酸樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列不同濃度（已知）DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可粗略比較出被測DNA溶液的濃度。溴乙錠熒光法一般與核酸電泳分析相結(jié)合進(jìn)行。2）操作步驟a.取一定量的DNA樣品（一般為1-5μl），加上1-2μl電泳上樣緩沖液（含溴酚藍(lán)），混勻后點(diǎn)樣至含0.5μg/ml溴乙錠的小型瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中。在樣品泳道的旁邊同時點(diǎn)上1至數(shù)個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品

（一般為DNAMarker）。b.電泳：凝膠孔一端朝向陰（黑線電極），無孔一端朝向陽極（紅線電極），在一定電壓下電泳一定時間，核酸由陰極度向陽極遷移，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠的一半距離為止。c.將凝膠浸入含0.01mol/L的MgCl2的電泳緩沖液中5分鐘，進(jìn)行背景脫色。d.用短波紫外線（254nm）進(jìn)行拍照，比較樣品DNA與Marker的熒光強(qiáng)度，確定樣品中DNA濃度。同時根據(jù)帶型分析核酸的完整度和純度。比色法與電泳法的比較比色法的優(yōu)點(diǎn)可以對核酸的濃度和純度準(zhǔn)確進(jìn)行量化分析，測定時一般不需要同時提供標(biāo)準(zhǔn)核酸樣品作對照，樣品測定后回收較方便。比色法的缺點(diǎn)不能直觀觀察到核酸分子量的帶型分布特征、核酸的完整性（降解程度）及雜質(zhì)核酸的污染程度。電泳法的優(yōu)點(diǎn)直觀可見，可根據(jù)核酸的電泳帶型分析核酸分子的完整性，雜質(zhì)核酸的污染情況，

直觀比較各帶型核酸的濃度。電泳法的缺點(diǎn)亮度與含量的相關(guān)性，低濃度下正相關(guān)，高于一定濃度嚴(yán)重偏離正相關(guān)；溴乙錠嵌入堿基中的多少與DNA的超螺旋程度密切相關(guān)；亮度受其它影響熒光發(fā)光污染物的影響，因此該法的準(zhǔn)確度較差。對于較重要的核酸定量分析，一般采用比色法與是電泳法二者結(jié)合，同時進(jìn)行，綜合分析。（五）核酸的保存1.DNA的保存DNA與RNA樣品貯存條件各異，對于DNA來說，最好是溶于TE中，TE中的EDTA可螯合金屬2價離子，抑制DNA酶的活性。TE的pH值為8，可減少DNA的脫氨反應(yīng)，并增加DNA的溶解度。短時間保存可放于4℃冷藏室，一般的長期保存只需放于-20℃，-70℃下DNA能保存5年以上。2.RNA的保存RNA酶極不易失活，RNA極易污染RNA酶而被降解。RNA溶可溶于0.3mol/L的醋酸鈉（pH5.2）

或無RNase的雙蒸消毒水（最好是Millipore級別的水）中，貯放于-70℃以下的超低溫冰箱中。RNA的長期保存，以沉淀形式貯存于乙醇中，在-20℃至-80℃的情況下，非常安全；或在RNA溶液中

加1滴

0.2mol/L的VRC（氧釩核糖核苷復(fù)合物）（抑制RNase），

-70℃，可保存數(shù)年。無論是DNA還是RNA，均宜于分成若干小份，

反復(fù)凍融易導(dǎo)致核酸的降解。二、電泳（一）凝膠電泳瓊脂糖或聚丙稀酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法簡單、快速，可直接用低濃度的溴化乙錠進(jìn)行染色，以確定DNA在凝膠中的位置。1～10ng的DNA就可以檢測出。瓊脂糖和聚丙稀酰胺凝膠可以制備成各種形狀、大小和孔隙度，并在各種裝置中進(jìn)行電泳。聚丙稀酰胺凝膠的分辨率可以達(dá)到1bp。一般在垂直裝置下使用。瓊脂糖凝膠電泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝膠，但其分離范圍較廣。一般在水平裝置下使用。1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線性高聚物，其基本結(jié)構(gòu)為：將瓊脂糖根據(jù)所需濃度，按比例加入到所用緩沖液中熔化成清澈、透明的液體，到入膠模中，冷卻凝固后，放入電場中。在中性pH中，核酸將從負(fù)極向正極遷移。瓊脂糖凝膠的制備及電泳（11步）1）根據(jù)所需濃度稱取一定量的瓊脂糖，加入所需體積的1×TAE或TBE電泳緩沖液。2）微波爐加熱使瓊脂糖溶解。3）溶液冷至60℃時，加入溴乙錠至終濃度為0.5μg/ml。（戴手套操作）4)用醫(yī)用膠布封好制膠模具，有的模具勿需人工封閉。5)將瓊脂糖倒入模具，并在一端安插上梳子，并消除氣泡。6）室溫下20-45分鐘至完全凝固，

低熔點(diǎn)凝膠應(yīng)于4℃凝固，

小心取出梳子和橡皮膏，將載有凝膠的載膠板放于電泳槽中。7）加入電泳緩沖液（與化膠時一致），讓液面高于膠面1mm。8）在DNA樣品中加入1/6體積的上樣緩沖液，混勻。9）用移液槍將DNA樣品小心加入樣品孔中。10）接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，切記DNA樣品往正極泳動。電壓降選擇為1-5V/cm。11）根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳，切斷電源后，再取出凝膠。含EB的凝膠直接于紫外線燈下觀察結(jié)果或拍照記錄。瓊脂糖凝膠電泳的注意事項1）上樣要慢而穩(wěn)，槍頭不要碰壞凝膠孔，加樣中要完全排出孔中的氣泡；2）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、樣品孔大小和膠的濃度。

超量上樣會導(dǎo)致帶型拖尾，輪廓不清。3）每孔不要上樣過滿，否則會導(dǎo)致樣品溢出和孔間交叉污染。4）每樣均更換一次性槍頭，避免交叉污染。拖尾5）電源接通前應(yīng)該核實(shí)凝膠的方向是否放置正確。6）電泳時兩極金屬絲上均有氣泡產(chǎn)生，陰極的氣泡應(yīng)比陽極的氣泡多一倍，幾分鐘后可見到溴酚蘭向陽極移動；7）電泳過程中，溴乙錠向負(fù)極移動，與DNA的泳動方問相反，較長時間的電泳會造成靠正極方向的凝膠中EB含量很低，對于小分子DNA片段檢測困難。解決方法是溴酚藍(lán)剛遷移至一半距離時停止電泳。8）EB導(dǎo)致DNA遷移速度下降并影響DNA帶型的整齊，較好的方法是在電泳后進(jìn)行EB染色。1242、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。?PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的 制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等。1251）聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理聚丙烯酰膠凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別分離物質(zhì)。這種介質(zhì)既具有分子篩效應(yīng)，又具備靜電效應(yīng)，所以分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳，具備分離只相差1個核苷酸的不同DNA片段的特性。丙烯酰胺單體（Acr）在催化劑N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的存在下產(chǎn)生聚合反應(yīng)，形成長鏈；加入交聯(lián)劑N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）后，聚丙烯酰胺鏈交叉連接而形成凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)灌制于兩塊封閉的平板之間，

（氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應(yīng)）然后進(jìn)行垂直電泳。2）聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)（與瓊脂糖比較）1）分辨率極高，即使最大的片段比最小的片段長500倍，也能很好地分離；2）載樣量大；3）回收的DNA樣品純度極高，可用于要求非常嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)；4）在凝膠的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，

帶有酰胺側(cè)鏈的C-C聚合物，不帶或少帶離子側(cè)鏈基團(tuán)。5）聚丙烯酰胺凝膠無色透明，比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收低，

抗腐蝕性強(qiáng)，機(jī)械強(qiáng)度高，韌性好。3.聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本步驟（12步）凝膠一般制成0.5-2mm厚度，過厚因產(chǎn)熱而導(dǎo)致帶型不整；丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，操作時應(yīng)小心，需戴手套和面罩。1）灌膠玻璃板的安裝與閉封。2）根據(jù)模具體積計算所需配制膠液的容積。3）向丙烯酰胺混合液中加入TEMED、AP，混勻后用注射器灌膠。4）立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙印?）室溫聚合1小時至凝固。6）小心取出梳子，立即用水沖洗孔格，將模具底部的膠帶撕去。7）將凝膠放入電泳槽，用夾子固定夾板。8）在上、下兩槽中灌好1×TBE溶液。9）將DNA樣品與適當(dāng)?shù)?倍上樣液混合，

用微量玻璃注射器上樣。

10）接通電源，正極輸出與下層貯液槽連接，電壓降一般為1-8V/cm。

11）根據(jù)指示劑遷移距離判定電泳是否應(yīng)中止。

停止電泳后，取出玻璃模具，拆去膠帶、上玻板和兩側(cè)墊條。

12）檢測

方法有溴乙錠染色后紫外線觀察、干膠后放射自顯影或銀染。3、SDS-凝膠電泳原理1）

聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉 (sodiumdodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。2）

加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白的二硫鍵 還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到P分子上，形成蛋白-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長橢圓形，短軸一定，長軸長度正比于蛋白分子量。3）分離測定：4）

測分子量(與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較)5）鑒定樣品純度(條帶數(shù)目)6）測定樣品蛋白含量：掃描定量(比色)凝膠電泳的操作要點(diǎn)凝膠制備電極緩沖液樣品處理及加樣電泳染色與固定脫色分析1334、等電點(diǎn)聚焦電泳電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。蛋白進(jìn)入時，不同的蛋白移動到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白得以分離。優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。缺點(diǎn)：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。134（二）雙向電泳是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行SDS（按分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離），經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。雙向電泳可鑒別出異常的蛋白質(zhì)，根據(jù)其氨基酸序列可追蹤相應(yīng)的突變基礎(chǔ)。135（三）毛細(xì)管電泳是Jorgenson