免疫分析專業(yè)課件

第十一章

免疫分析技術(shù)和相關(guān)儀器1歡迎下載可修改第一節(jié)酶免疫分析儀一、酶免疫分析技術(shù)的分類：酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物，可分為:

酶擴(kuò)大免疫測定均相酶免疫測定克隆酶供體免疫測定

液相酶免疫法非均相酶免疫測定固相酶免疫法(酶聯(lián)免疫吸附測定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）2歡迎下載可修改需要了解的基本概念酶免疫測定（EnzymeImmunoassay,EIA)均相酶免測定對象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測定異相酶免測定需經(jīng)過結(jié)合的標(biāo)記物和游離的標(biāo)記物的分離才能測定.分離的方法主要通過固相載體，故此法稱為固相酶免疫測定ELISA。ELISA的測定模式:雙抗體夾心法間接法競爭法3歡迎下載可修改雙抗體夾心法（三明治法）原理固相支持物表面包被抗體標(biāo)記抗體待測物4歡迎下載可修改夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號強(qiáng)度（Y）線性范圍待測物濃度（X）Hook效應(yīng)5歡迎下載可修改競爭法的原理固相支持物表面待測物包被抗體標(biāo)記抗原6歡迎下載可修改競爭法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測物濃度（X）信號強(qiáng)度（Y）線性范圍7歡迎下載可修改間接法原理包被體待測抗體包被抗原標(biāo)記抗體（二抗）8歡迎下載可修改俘獲法原理俘獲抗體（二抗）待測抗體標(biāo)記抗原包被體9歡迎下載可修改雙抗原夾心法原理包被體待測抗體包被抗原標(biāo)記抗原10歡迎下載可修改9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:48PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

我們把采用酶標(biāo)的方法測定物質(zhì)含量的設(shè)備稱為酶標(biāo)儀。一般簡單的酶標(biāo)儀只有讀數(shù)、數(shù)據(jù)處理的功能，還需要配置孵育箱，洗板機(jī)，人工操作步驟繁瑣。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫系統(tǒng)集加樣品、加試劑、孵育、震蕩、洗板、讀數(shù)、數(shù)據(jù)處理7大功能于一體。12歡迎下載可修改9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:48PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3二、酶免疫分析儀的類型、工作原理及基本結(jié)構(gòu)微孔板固相酶免疫測定儀器(酶標(biāo)儀)半自動(dòng)微孔板ELISA分析儀全自動(dòng)微孔板ELISA分析儀管式固相酶免疫測定儀器小珠固相酶免疫測定儀器磁微粒固相酶免疫測定儀器等14歡迎下載可修改有單通道和多通道兩種類型工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計(jì)相同不同之處在于：

比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通過待測液通常使用光密度OD來表示吸光度1、微孔板固相酶免疫測定儀器15歡迎下載可修改16歡迎下載可修改17歡迎下載可修改2、半自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀在酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上再配置:加液器溫育器洗板機(jī)測讀儀

測定中需由手工將微孔板移至下一步驟的儀器中進(jìn)行。18歡迎下載可修改3、全自動(dòng)微孔板式ELISA分析儀自動(dòng)化酶免疫分析系統(tǒng)由:加樣系統(tǒng)溫育系統(tǒng)洗板系統(tǒng)判讀系統(tǒng)機(jī)械臂系統(tǒng)液路動(dòng)力系統(tǒng)軟件控制系統(tǒng)等組成19歡迎下載可修改20歡迎下載可修改溫育箱反應(yīng)板迭式存儲(chǔ)器21歡迎下載可修改X-Y頭架22歡迎下載可修改

樣品架

50根裝

50×323歡迎下載可修改

4根獨(dú)立上下吸移管24歡迎下載可修改

檢

測

光

纖25歡迎下載可修改

反應(yīng)板

反應(yīng)板夾具26歡迎下載可修改

清洗裝置27歡迎下載可修改

供水箱

廢水箱28歡迎下載可修改檢測時(shí)間:以乙肝兩對半（立可讀）為例

儀器操作各單元如下（滿板）加樣品時(shí)間：6-7分鐘；9-10分鐘（使用液面?zhèn)鞲衅鳎┘用笗r(shí)間：4分46秒(洗5遍，不浸泡)加兩種顯色劑A、B共：5分30秒加終止液：2分42秒讀板時(shí)間：2分58秒29歡迎下載可修改優(yōu)勢自動(dòng)化程度高：

前后處理一體化設(shè)計(jì)，減少人與樣品的接觸機(jī)會(huì)，降低感染。各種自動(dòng)安全檢測能。穩(wěn)定：

只要避免人為操作錯(cuò)誤，可連續(xù)數(shù)年良好工作。準(zhǔn)確：

不存在交叉感染。反應(yīng)振蕩，確保檢測準(zhǔn)確。30歡迎下載可修改高速：

加注、讀板速度快擴(kuò)展性：

軟件可升級，樣本量增加，可聯(lián)機(jī)使用用戶做主更多：

開放式試劑

WINDOW操作系統(tǒng)中/英/日自選操作界面自定義編程自動(dòng)/自定義時(shí)間表無限存檔31歡迎下載可修改4、管式固相酶免疫測定儀1990年德國推出的全自動(dòng)管式ELISA分析系統(tǒng)和配套試劑用鏈霉親和素包被的聚苯乙烯管、生物素結(jié)合的抗原或抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體和顯色底物ABTS測定中標(biāo)準(zhǔn)曲線可使用2星期，每次測定只需一點(diǎn)定標(biāo)測定的精密度CV在3%左右32歡迎下載可修改5、微粒固相酶免疫測定儀美國生產(chǎn)自動(dòng)酶免疫分析儀應(yīng)用聚苯乙烯微粒（顆粒直徑0.47μm）作為固相，特異抗體或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗體反應(yīng)后，將反應(yīng)液通過特制的玻璃纖維膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纖維膜上，液體則通過膜濾出。以后的反應(yīng)在膜上進(jìn)行，標(biāo)記酶為ALP，底物為4-甲基傘酮磷酸酶，反應(yīng)后進(jìn)行熒光測定。33歡迎下載可修改6、磁微粒固相酶免疫測定儀

瑞士出品的分析系統(tǒng)由分光光度測讀儀、磁鐵板和試劑組成：試劑包括：抗異硫氰酸熒光素（FITC）抗體特異抗體或抗原包被的磁微粒（顆粒直徑1μm）FITC結(jié)合的特異抗體或抗原堿性磷酸酶標(biāo)記的特異抗體或抗原底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯反應(yīng)結(jié)束后將試管架放在磁鐵板上，磁微粒被磁鐵吸引至管底，完成固相與液相的分離。酶作用后反應(yīng)液呈粉紅色。什么樣的反應(yīng)34歡迎下載可修改磁顆粒ELISA是將兩株單抗分別標(biāo)記酶和異硫氰酸熒光素(FITC)，另將一抗FITC抗體經(jīng)化學(xué)反應(yīng)與磁顆粒偶聯(lián)，制成可磁化固相通用分離劑。測定時(shí)將樣品和兩種標(biāo)記單抗加至試管中溫育，然后加入可磁化抗FITC顆粒分離劑，生成夾心免疫復(fù)合物，洗滌，加酶底物顯色。35歡迎下載可修改三、酶免疫分析儀的性能評價(jià)和維護(hù)保養(yǎng)（一）評價(jià)指標(biāo)和方法1．濾光片波長精度檢查及其峰值測定2．靈敏度和準(zhǔn)確度3．通道差與孔間差檢測4．零點(diǎn)飄移5．精密度評價(jià)6．線性測定7．雙波長評價(jià)36歡迎下載可修改重點(diǎn)是光學(xué)部分

1．濾光片波長精度檢查

2．通道差與孔間差檢測37歡迎下載可修改四、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用１．病原體及其抗體的檢測

2．各種免疫球蛋白和細(xì)胞因子、補(bǔ)體等

3．腫瘤標(biāo)志物

4．多種激素

5．藥物和毒品38歡迎下載可修改辣根過氧化物酶的色原底物HRP最常用的色原底物有:鄰苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6)[ABTS](雜環(huán)吖嗪)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)4-氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對39歡迎下載可修改OPD被認(rèn)為是HRP最為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫(H202)氧化而聚合成2，2’-二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5.0左右時(shí)，DAB在波長450nm處有廣范圍的最大吸收，當(dāng)pH值降為1.0時(shí)，最大吸收波長移動(dòng)至492nm，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深。因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。OPD的缺點(diǎn)是其對機(jī)體具有致突變作用。40歡迎下載可修改TMB的顯色反應(yīng)雖與OPD一樣同屬氧化還原反應(yīng)，但前者的反應(yīng)是可逆的，如終止液中存在還原劑(維生素C及亞硫酸鈉、SDS等)，則可反應(yīng)顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對較低，但由于其高檢測敏感性及無致突變作用，現(xiàn)已基本上取代了OPD而成為HRP最為常的色原底物。測定波長：450nm41歡迎下載可修改氧化耦聯(lián)色原底物對HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對主要有4-氨基安替比林:苯酚耦聯(lián)底物對(Trinder試劑)和2-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺(DMA)耦聯(lián)底物對(Ngo—Lenhoff試劑)等。在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在492nm處有最大吸收42歡迎下載可修改9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***2/3/20234:42:48PM11、人總是珍惜為得到。03-2月-23**Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。***Frid