醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)課件

醫(yī)療器械微生物限度檢驗(yàn)2021/4/261精品概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。微生物限度檢查細(xì)菌、真菌菌落數(shù)控制菌2021/4/262精品概述微生物：形體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物特點(diǎn)：1、個(gè)體微小，一般<0.1mm

2、構(gòu)造簡(jiǎn)單，有單細(xì)胞的，簡(jiǎn)單多細(xì)胞的，非細(xì)胞的

3、進(jìn)化地位低分類：原核類：二菌，四體（細(xì)菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體）真核類：真菌，原生動(dòng)物，顯微藻類

非細(xì)胞類：病毒，亞病毒2021/4/263精品2021/4/264精品概述醫(yī)療用品的分類按醫(yī)療用品與人體接觸的性質(zhì)以及對(duì)人體使用安全性要求分三類：

a)Ⅰ類醫(yī)療用品：接觸人體完整皮膚的醫(yī)療用品

b)Ⅱ類醫(yī)療用品：接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品

c)Ⅲ類醫(yī)療用品：進(jìn)入人體無菌組織、器官和血液以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療用品

2021/4/265精品常用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”GB15979-2002《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄BISO11737-1:2006Sterilizationofmedicaldevices–Microbiologicalmethods—Part1:Determinationofapopulationofmicroorganismsonproducts2021/4/266精品項(xiàng)目《藥典》2010GB15979-2002細(xì)菌定量：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2個(gè)平皿定量：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基5個(gè)平皿真菌定量：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基至少2個(gè)平皿72h

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基定量：沙氏瓊脂培養(yǎng)基5個(gè)平皿7天定性：沙氏液體培養(yǎng)基7天大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基/大腸菌群膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基沙門菌營(yíng)養(yǎng)肉湯、四硫酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基/銅綠假單胞菌膽鹽乳糖、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、SCDLP培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)金黃色葡萄球菌亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、血漿凝固酶試驗(yàn)SCDLP培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)梭菌庖肉培養(yǎng)基、含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、過氧化氫酶試驗(yàn)/溶血性鏈球菌/葡萄糖肉湯、血瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌試驗(yàn)、桿菌肽敏感試驗(yàn)白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基、1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基、芽管試驗(yàn)/2021/4/267精品實(shí)驗(yàn)條件無菌操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)器材2021/4/268精品無菌操作技術(shù)微生物學(xué)基礎(chǔ)微生物實(shí)踐基礎(chǔ)無菌操作意識(shí)2021/4/269精品實(shí)驗(yàn)環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng)；定期按GB/T16292-16294：2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證；實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控：實(shí)驗(yàn)時(shí)將制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板打開放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束收起，30℃~35℃培養(yǎng)48h，菌落平均數(shù)應(yīng)小于1cfu/φ90mm。2021/4/2610精品9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:53:14PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3實(shí)驗(yàn)器具

儀器超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過濾裝置、比濁儀等。用具試管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH試紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無菌服、牛皮紙等。2021/4/2612精品實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證實(shí)驗(yàn)試液培養(yǎng)基滅菌方法2021/4/2613精品實(shí)驗(yàn)環(huán)境保證環(huán)境清潔，表面消毒（75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液）空氣過濾系統(tǒng)，紫外燈或臭氧空氣消毒儀2021/4/2614精品實(shí)驗(yàn)試液稀釋劑

1.0.9%氯化鈉溶液

2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液

3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液：調(diào)解pH至近中性，其中蛋白胨對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有保護(hù)作用有利于菌落數(shù)及控制菌測(cè)定。表面活性劑、中和劑或滅活劑鑒定用試劑

1.靛基質(zhì)試液

2.1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液（氧化酶試液）

3.三氯甲烷

4.1mol/l鹽酸試液2021/4/2615精品培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)菌株處理及增菌用培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基2021/4/2616精品培養(yǎng)基培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長(zhǎng)要求。應(yīng)按各種培養(yǎng)基要求準(zhǔn)確測(cè)定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜pH值為7.2～7.6。酵母菌霉菌（6.0～6.5）。調(diào)節(jié)可用1NHCl或NaOH。培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，應(yīng)按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營(yíng)養(yǎng)成分。制成的培養(yǎng)基應(yīng)透明，以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀以及其他代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。2021/4/2617精品滅菌方式濕熱：115℃~121℃，15min~30min

物品切勿立即取出置冷處，以免急速冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負(fù)壓，以致染菌。干熱：160℃~170℃，2h

適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。滅菌程序需要經(jīng)過驗(yàn)證。2021/4/2618精品計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。2021/4/2619精品計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌種大腸埃希菌［CMCC（B）44102］金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］白色念珠菌[CMCC(F)

98001]

黑曲霉[CMCC(F)98003]

驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。2021/4/2620精品計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物（一般18h~24h，白念24h~48h，黑曲霉5~7天），用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)50cfu~100cfu的菌懸液（黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液）；菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2℃～8℃可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。2021/4/2621精品計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種

金黃色葡萄球菌2個(gè)平皿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希菌2個(gè)平皿枯草芽孢桿菌2個(gè)平皿

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌2個(gè)平皿黑典霉2個(gè)平皿酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：白色念珠菌2個(gè)平皿用相同的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對(duì)照2021/4/2622精品計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判定若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。2021/4/2623精品樣品準(zhǔn)備供試品進(jìn)入無菌實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)作表面消毒，用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒。檢驗(yàn)數(shù)量：應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。2021/4/2624精品樣品準(zhǔn)備檢驗(yàn)量：除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；化學(xué)膜劑100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對(duì)照試驗(yàn)）。2021/4/2625精品供試液制備液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品取10ml或10g用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無菌吐溫80使供試品分散均勻;

水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液；非水溶性供試品：乳化或萃取;膜劑供試品：取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡，振搖，作為1：10的供試液;腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品：取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液;氣霧劑、噴霧劑供試品，經(jīng)處理后同第一項(xiàng)制備供試液;貼劑供試品具抑菌活性的供試品：培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法;2021/4/2626精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)方法傾注平皿法薄膜過濾法培養(yǎng)基細(xì)菌總數(shù)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基2021/4/2627精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)必要時(shí)可延長(zhǎng)至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)2021/4/2628精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證（1）試驗(yàn)組平皿法：供試液1ml+1ml試驗(yàn)菌菌懸液，平行制備2個(gè)平皿，菌落計(jì)數(shù)；薄膜過濾法：供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗(yàn)菌，過濾，菌落計(jì)數(shù)；（2）菌液組測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)；（3）供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)；（4）稀釋劑對(duì)照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗(yàn)菌菌懸液；2021/4/2629精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%；若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均不低于70%，可照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。2021/4/2630精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)1.平皿法采用平皿法進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定時(shí)，應(yīng)取適宜的連續(xù)2~3個(gè)稀釋級(jí)的供試液。取供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15~20ml溫度不超過45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。2021/4/2631精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)營(yíng)養(yǎng)瓊脂-細(xì)菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌2021/4/2632精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)1.平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)；以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)；如果各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅是最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。2021/4/2633精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)2.薄膜過濾法取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g或1ml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。2021/4/2634精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)2.薄膜過濾法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌生長(zhǎng)，以＜1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或＜1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

2021/4/2635精品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。2021/4/2636精品2021/4/2637精品控制菌檢查法驗(yàn)證菌種（菌液制備同前）大腸埃希菌［CMCC（B）44102］金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］生孢梭菌[CMCC(B)64941]2021/4/2638精品控制菌檢查法驗(yàn)證（1）試驗(yàn)組取規(guī)定量供試液及10cfu~100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。（2）陰性菌對(duì)照組設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。結(jié)果判斷陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。2021/4/2639精品大腸埃希菌檢驗(yàn)

取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18~24小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。2021/4/2640精品大腸埃希菌檢驗(yàn)MUG靛基質(zhì)試驗(yàn)2021/4/2641精品大腸埃希菌檢驗(yàn)如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。2021/4/2642精品大腸埃希菌檢驗(yàn)大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色、菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心、圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)2021/4/2643精品大腸菌群檢驗(yàn)取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作為陰性對(duì)照管。培養(yǎng)18~24小時(shí)。2021/4/2644精品大腸菌群檢驗(yàn)?zāi)扄}乳糖發(fā)酵管若無菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18~24小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。2021/4/2645精品大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)

麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)2021/4/2646精品大腸菌群檢驗(yàn)確證試驗(yàn)從上述分離平板上挑選4~5個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24~48小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按下表報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。2021/4/2647精品可能的大腸菌群數(shù)表2021/4/2648精品沙門菌檢驗(yàn)取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)18~24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18~24小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18~24小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至40~48小時(shí)）。若平板上無菌生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。2021/4/2649精品沙門菌檢驗(yàn)沙門菌菌落形態(tài)特征2021/4/2650精品沙門菌檢驗(yàn)若平板上生長(zhǎng)的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2~3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18~24小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。2021/4/2651精品銅綠假單胞菌檢驗(yàn)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18~24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18~24小時(shí)。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2~3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18~24小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。2021/4/2652精品銅綠假單胞菌檢驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。綠膿菌素試驗(yàn)取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷3~5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/l鹽酸試液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素試驗(yàn)陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。2021/4/2653精品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24~72小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選2~3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18~24小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18~24小時(shí)，作血漿凝固酶試驗(yàn)。2021/4/2654精品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7~1mm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1~2mm2021/4/2655精品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn)取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗(yàn)管、陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管。將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí)。陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如，陽性對(duì)照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。如陽性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。2021/4/2656精品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。2021/4/2657精品梭菌檢驗(yàn)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g，1ml）2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。再取上述培養(yǎng)物0.2ml，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)48~72小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2~3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。過氧化氫酶試驗(yàn)取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。2021/4/2658精品白色念珠菌檢驗(yàn)取供試液10ml（相當(dāng)于