細(xì)菌感染病原學(xué)診斷

第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷

褚云卓2/3/20231本章內(nèi)容第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法2/3/20232第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則一、標(biāo)本采集的一般原則1．早期采集2．無菌采集3．根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集4．采集適量標(biāo)本5．安全采集

2/3/20233第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則二、標(biāo)本的處理1.對環(huán)境敏感的細(xì)菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌等應(yīng)保溫并立即送檢2.其他所有的標(biāo)本采集后最好在2h之內(nèi)送到實驗室3.若不能及時送檢，標(biāo)本應(yīng)置于一定環(huán)境中保存4.一般情況下，用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本保存時間不應(yīng)超過24h2/3/20234５.病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護６.標(biāo)本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出７.對于烈性傳染病標(biāo)本運送時更要特別嚴(yán)格，必須按規(guī)定包裝，由專人運送８.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運送瓶或試管內(nèi)運送，有時可直接用抽取標(biāo)本的注射器運送2/3/20235第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查1.包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法2.鏡檢可以了解有無細(xì)菌及大致的菌量3.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類4.通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義2/3/20236第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查一、不染色標(biāo)本1.細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及運動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴法有動力：可看到細(xì)菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移無動力：細(xì)菌呈現(xiàn)布朗運動，只在原地顫動而無位置的改變2/3/20237第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3.有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力檢查可作出初步鑒定如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運動的細(xì)菌，制動試驗陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。2/3/20238第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查二、染色標(biāo)本（一）常用染料1．堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍等2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等3．復(fù)合染料（中性染料）及熒光染料：復(fù)合染料有瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標(biāo)記的抗體

2/3/20239第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（二）常用的染色方法1．革蘭染色（gramstain）革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌2/3/202310第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查2．抗酸染色（acid-faststain）可將細(xì)菌分為兩大類：即-抗酸性細(xì)菌-非抗酸性細(xì)菌2/3/202311第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實用價值。（2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。2/3/202312第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4.鞭毛染色可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色。2/3/202313第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查6.芽胞染色：綠色部分為芽胞2/3/202314第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查7.墨汁染色:一般用于新型隱球菌檢查2/3/202315第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基的選擇二、分離及培養(yǎng)細(xì)菌的分離、細(xì)菌培養(yǎng)方法三、生化反應(yīng)和鑒定碳水化合物的代謝試驗蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗碳源和氮源利用試驗2/3/202316第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。

2/3/202317第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定(一)培養(yǎng)基的組成成分1．營養(yǎng)物質(zhì)蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2．凝固物質(zhì)瓊脂、明膠、卵白3．抑制劑和指示劑2/3/202318第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）培養(yǎng)基種類1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basedmedium）2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）4．選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）2/3/202319第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。2/3/202320第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等2/3/202321第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定

3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養(yǎng)基等。2/3/202322第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．選擇培（selectivemedium）SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到2/3/202323第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸納培養(yǎng)基2/3/202324第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。伊紅美藍/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌。2/3/202325第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇從血液、骨髓中分離病原菌用血液增菌培養(yǎng)基2/3/202326第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．平板劃線分離法2．斜面接種法3．液體接種法二、分離及培養(yǎng)（一）細(xì)菌的分離4．穿刺接種法5．傾注平板法6．涂布接種法2/3/202327第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法2．二氧化碳培養(yǎng)法3．厭氧培養(yǎng)法

2/3/202328第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定三、生化反應(yīng)和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要2/3/202329第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．氧化―發(fā)酵試驗（O/F試驗）主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。2/3/202330第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。2/3/202331第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．七葉苷水解試驗主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5．甲基紅試驗主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌。6．V―P試驗本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細(xì)菌，后者通常為陰性。2/3/202332第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．吲哚(靛基質(zhì))試驗主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1．明膠液化試驗主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。2/3/202333第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硫化氫試驗培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別2/3/202334第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．尿素分解試驗主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌科中其他細(xì)菌均為陰性。6．氨基酸脫羧酶試驗主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。2/3/202335第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗1．枸櫞酸鹽利用試驗用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2．丙二酸鹽利用試驗?zāi)c桿菌科中屬間及種的鑒別。2/3/202336第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（四）各種酶類試驗1．氧化酶試驗主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。2．過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）用于革蘭陽性球菌的初步分群。2/3/202337第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硝酸鹽還原試驗本試驗在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。2/3/202338第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒別。5．卵磷脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒定。6．

DNA酶試驗在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生

DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。2/3/202339第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定8．

CAMP試驗在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。7．凝固酶試驗作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。2/3/202340第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（五）抑菌試驗1．O/129抑菌試驗用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2．桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3．奧普托欣（Optochin）試驗主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。2/3/202341第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學(xué)檢測核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、生物芯片技術(shù)三、細(xì)菌毒素的檢測內(nèi)毒素、外毒素四、動物實驗

2/3/202342第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（一）抗原檢測免疫熒光技術(shù)是利用免疫學(xué)特異性反應(yīng)與熒光示蹤技術(shù)相結(jié)合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學(xué)的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細(xì)菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。2/3/202343第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（二）抗體檢測抗體的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價的升高。因此用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強的致病菌和病程較長的感染性疾病。2/3/202344第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測（一）核酸雜交DNA可進行變性、復(fù)性、雜交。我們利用這一特性，制備特定序列DNA片段，進行標(biāo)記后用作探針，在一定條件下，按照堿基互補配對原則與標(biāo)本中已變性的細(xì)菌DNA進行雜交，通過檢測雜交信號確定是否發(fā)生雜交反應(yīng)，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原菌基因。2/3/202345第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測（一）核酸雜交1.探針的種類（1）全染色體DNA探針（2）染色體克隆片段DNA探針（3）質(zhì)粒DNA探針（4）rRNA基因探針（5）寡核苷酸探針2/3/202346第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法2．核酸雜交在臨床細(xì)菌檢測中的應(yīng)用（1）細(xì)菌分類鑒定（2）細(xì)菌快速鑒定（3）細(xì)菌耐藥性的檢測（4）細(xì)菌毒素的檢測（5）細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查2/3/202347第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）1.特異性DNA體外擴增技術(shù)2.特異、靈敏、快速、操作簡便3.廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定2/3/202348第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法PCR在臨床細(xì)菌檢測中的應(yīng)用1.細(xì)菌的快速檢測2.細(xì)菌毒素的檢測3.細(xì)菌耐藥性的檢測4.細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查2/3/202349第四節(jié)

細(xì)菌的非培