細(xì)胞工程期末總復(fù)習(xí)

細(xì)胞工程期末總復(fù)習(xí)一、無菌操作1、點(diǎn)燃酒精燈，所有操作均在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行；2、冷卻后才能使用；3、操作時(shí)，打開試管蓋，要進(jìn)行燒灼滅菌，但是時(shí)間要短。在火焰上燒瓶口。保證容器傾斜。4、進(jìn)行操作時(shí)動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但是不宜太快，防止空氣流動(dòng)，增加污染的機(jī)會(huì)；5、超凈工作臺(tái)上的器具和用品要擺放合理；6、操作時(shí)器具不能觸及瓶口以防止污染；7、不要說話接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速防止操作帶來的污染，接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生二、細(xì)胞分裂指數(shù)指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占的百分率，用以表示細(xì)胞的增殖旺盛程度。一般要計(jì)算和觀察1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)。三、活體染色體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即活體染料）對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動(dòng)的一種方法。利用這種方法，可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，染色后的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。四、密度抑制（densityinhibition）

只要營(yíng)養(yǎng)充分，接觸抑制的細(xì)胞仍能分裂增殖。但細(xì)胞密度進(jìn)一步加大、營(yíng)養(yǎng)減少、代謝產(chǎn)物增多時(shí)，（因營(yíng)養(yǎng)和代謝物的影響）細(xì)胞分裂停止，出現(xiàn)接觸抑制。五、原代培養(yǎng)的分類

1、組織塊培養(yǎng)

處死動(dòng)物，無菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎片，補(bǔ)加3-5mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。

2、組織消化培養(yǎng)

（1）取材、分離、消化消化軟組織：0.25%胰蛋白酶消化纖維組織：0.1-0.3mg/ml膠原酶消化傳代細(xì)胞（制成細(xì)胞懸液）：EDTA+胰蛋白酶

(2)、培養(yǎng)：接種：接種量大小視情況而定；防污染；常規(guī)檢查：1-2天做一次。六、貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

1、游離期：接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。

2、吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時(shí)間有差異。貼壁快：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞，傳代細(xì)胞；貼壁慢：組織塊，較大細(xì)胞團(tuán)；不利于細(xì)胞貼壁的：細(xì)胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基pH不正常，培養(yǎng)瓶不潔。

3、繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞，此時(shí)有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，無細(xì)胞分裂。經(jīng)一段停滯，開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，開始接觸并連接成片，這時(shí)細(xì)胞分裂及運(yùn)動(dòng)停止。

4、退化期：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)一定密度，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開始退化。七、細(xì)胞融合（又稱體細(xì)胞雜交、細(xì)胞雜交）

在離體條件下用人工方法將不同種或同種不同類型的單細(xì)胞通過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞,用于生產(chǎn)特殊生物制品、產(chǎn)生新物種或新品種的技術(shù)。

細(xì)胞融合技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞工程的誕生。

八、雜交瘤技術(shù)的基本原理（重難點(diǎn)）

Burnet(1957)提出克隆選擇理論：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一種類型的免疫球蛋白分子，那么，從一個(gè)單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體分子就是單克隆的，且該單克隆抗體具有獨(dú)特的均一結(jié)構(gòu)。此假定經(jīng)各種實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。傳統(tǒng)的抗體制備（多抗）：沒有通過細(xì)胞的克隆階段，一群B淋巴細(xì)胞接受一種抗原分子刺激，分泌針對(duì)一種分子的多個(gè)抗原決定簇的抗體。

將瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合，培養(yǎng)成既能產(chǎn)生單一抗體，又能在體外快速生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞。該雜交瘤細(xì)胞群經(jīng)單克隆化，持續(xù)分泌成分單一的針對(duì)一個(gè)決定簇的特異性抗體，稱為單克隆抗體（mono-clonalantibody,MCAB）。

骨髓瘤細(xì)胞（A）與淋巴細(xì)胞（B）融合的混合物中有五種細(xì)胞：沒融合的兩種細(xì)胞（A、B）、兩種細(xì)胞的自我融合細(xì)胞（同核體）（AA、BB）、兩種細(xì)胞互相融合的雜交瘤細(xì)胞（異核體）（AB）。1、親本細(xì)胞的選擇要求（1）骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞本身不分泌抗體（保障雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單抗）；有無限分裂的能力；次黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT－）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK－）——保證在HAT培養(yǎng)基中不能生存增殖。HAT培養(yǎng)基用于篩選具有次黃嘌呤（鳥嘌呤）磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(H（G）PRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷細(xì)胞的培養(yǎng)基。

HAT選擇培養(yǎng)基的作用是篩選出（雜交瘤細(xì)胞）

（2）B淋巴細(xì)胞：

經(jīng)特定抗原免疫能產(chǎn)生目的抗體的淋巴細(xì)胞，且被免疫動(dòng)物種系與骨髓瘤細(xì)胞一致或相近親緣關(guān)系。

2、HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤的原理：

為去除未融合的骨髓瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶脫氧核苷（T）。A阻斷正常細(xì)胞DNA合成主路途徑（二氫葉酸到四氫葉酸），故只有能利用H和T的正常細(xì)胞從旁路合成DNA才不死亡。

骨髓瘤細(xì)胞：（

HGPRT－和TK－）無法利用旁路合成DNA，主路又被A阻斷，故單純的瘤細(xì)胞不久即死亡。

B細(xì)胞：有最高分裂次數(shù)或不分裂，死亡。

雜交瘤細(xì)胞：具有瘤細(xì)胞（無限分裂的能力）特性和野生型淋巴細(xì)胞（HGPRT+和TK+）旁路合成DNA的特性，長(zhǎng)期生存，從而被分離出來。雜交瘤制備的過程

1、親本細(xì)胞的準(zhǔn)備：1）脾淋巴細(xì)胞：處死小鼠、摘下脾臟，得到淋巴細(xì)胞2）骨髓瘤細(xì)胞：臺(tái)盼藍(lán)染液檢查細(xì)胞活性，活細(xì)胞80%以上2、細(xì)胞雜交融合：按4:1~10:1的比例將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，PEG促融（37℃），離心收集3、分裝培養(yǎng)篩選：一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。培養(yǎng)5~6天有雜交瘤細(xì)胞克隆出現(xiàn)，未融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞5~7天后逐漸死亡。

4、抗體檢測(cè)（1）抗原結(jié)合法：（2）第二抗體法：5、雜交瘤細(xì)胞的克?。?）有限稀釋法：（2）軟瓊脂法：九、胚胎移植（embryotransfer）

也稱受精卵移植，一頭母畜（供體）發(fā)情排卵經(jīng)配種后，在一定時(shí)間內(nèi)從其生殖道（輸卵管、子宮角）取出受精卵或胚胎，移植到另一頭與供體同時(shí)發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（受體）的相應(yīng)部位（輸卵管、子宮角）。經(jīng)胚胎著床、生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)下供體的后代。供體：品質(zhì)優(yōu)良受體：繁殖力好原則：從何處取出移植到何處。十、胚胎移植的目的（意義）1結(jié)合人工受精、冷凍精液：最大限度利用優(yōu)良種公畜，加快家畜優(yōu)良品種的推廣速度。2發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力3作為胚胎操作的基礎(chǔ)4保存遺傳資源5結(jié)合低溫冷凍技術(shù)，可以不受時(shí)間、地點(diǎn)限制，把受精卵或胚胎進(jìn)行長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸。

十一、干細(xì)胞及其分類

干細(xì)胞是指動(dòng)物有機(jī)體在最初形成發(fā)育為完整個(gè)體的過程中，始終保留的部分未分化的原始細(xì)胞。具有分裂完成自我更新和分化形成新類型細(xì)胞的能力。按分化潛能大小分類：1.全能干細(xì)胞：具形成完整個(gè)體的分化潛能。如ES細(xì)胞2.多能干細(xì)胞：具分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力。如骨髓多能造血干細(xì)胞（分化出12種血細(xì)胞）。3.定向干細(xì)胞：或單(專)能干細(xì)胞、偏能干細(xì)胞。只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如表皮干細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞等。十二、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的概念及異同點(diǎn)1.

ES細(xì)胞（embryonicstemcell）：存在于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能干細(xì)胞，是一種高度未分化的、與早期胚胎細(xì)胞的形態(tài)特征相似、有很強(qiáng)分化能力的細(xì)胞系。可無限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，形成機(jī)體所有組織器官。

目前，ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化已成為干細(xì)胞工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、組織工程、基因治療、臨床移植的細(xì)胞來源。2.

EG細(xì)胞（embryonicgermcell）從早期胎兒生殖嵴原始生殖細(xì)胞(primodialgermcell)分離的多能性干細(xì)胞，稱為EG細(xì)胞。(哺乳動(dòng)物生殖嵴起源于中間中胚層，具有雙向性發(fā)育的特點(diǎn)。)3.

ES細(xì)胞與EG細(xì)胞的異同

（1）相同點(diǎn)：1）各種動(dòng)物的ES細(xì)胞直徑12~15μm，EG細(xì)胞的15~18μm；2）EG細(xì)胞與ES細(xì)胞均具有高核質(zhì)比率；3）表達(dá)較高水平的AKP活性和端粒酶活性；4)EG和ES細(xì)胞都表達(dá)Oct-4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（維持細(xì)胞多能性的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子）；5)體外形成的類胚體都進(jìn)一步分化為多種類型細(xì)胞：造血、心肌、神經(jīng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。（2）差異：

1)胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（1gf2r）甲基化狀態(tài)不同；2)EG細(xì)胞：小鼠表達(dá)SSEA-1,而人類表達(dá)SSEA-3和高分子糖蛋白；3)小鼠ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-1外，還表達(dá)起源因子（genesis）、生殖細(xì)胞核因子（germcellnuclearfactor）、生長(zhǎng)分化因子3（GDF-3）；4)EG細(xì)胞與宿主胚胎嵌合時(shí)畸胎瘤的形成率要高些。

SSEA:階段特異性胚胎抗原十三、等密度沉降分離法

據(jù)細(xì)胞密度差異分離細(xì)胞。細(xì)胞在連續(xù)密度梯度分離介質(zhì)中，受強(qiáng)離心力的作用，最后達(dá)到與其密度相同的分離介質(zhì)層面，并保持平衡。非連續(xù)密度梯度介質(zhì)：細(xì)胞集中在介于自身密度的兩種密度介質(zhì)的交界面上。2胚胎干細(xì)胞核移植法胚胎干細(xì)胞經(jīng)（？）抑制分化培養(yǎng)——核移入去核卵母細(xì)胞中——胚胎——個(gè)體。成功分離出干細(xì)胞的：小鼠、牛、豬、羊、兔等克隆成功的：小鼠。未著床早期胚胎——顯微手術(shù)——2、4、6等份——植入受體而妊娠產(chǎn)仔——遺傳性能一樣的個(gè)體。二等份成功的：小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、馬、牛等。四等份成功的：小鼠、綿羊、牛。六等份：小鼠。（算不上真正意義上的克隆，應(yīng)是“多胞胎復(fù)制）1胚胎分割法十四、哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)

十五、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器的原理：通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)方法，將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列之下，使之在乳腺中表達(dá)，然后通過回收乳汁獲得重要價(jià)值的生物活性蛋白。應(yīng)用：改良乳汁；生產(chǎn)藥用蛋白。制備：構(gòu)建載體→選擇目的基因→體外重組→導(dǎo)入受體（全能性細(xì)胞）→胚胎發(fā)育與移植→產(chǎn)出個(gè)體、性狀鑒定。十六、雌核發(fā)育

核失活或消失的精子與正常卵子受精，僅由母體基因（卵子）形成（二倍體）胚胎發(fā)育為（二倍體)個(gè)體的現(xiàn)象?？勺匀话l(fā)生和人工誘導(dǎo)。

雌核發(fā)育的意義：（1）產(chǎn)生單性種群：（2）同源型二倍體克隆

雄核發(fā)育（androgenesis）：二倍體雄核生殖的個(gè)體生存率很低：精子基因的純合性、卵子的損傷、阻止第一次卵裂的損傷。

意義：遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論、育種應(yīng)用、核質(zhì)雜種、性別控制（yy雄性）十七、酵母人工染色體1983年首次構(gòu)建YAC(含染色體三要素和外源DNA，55kb)；1987年構(gòu)建并證明載體YAC：能克隆大片段人體DNA分子，可用于構(gòu)建高等生物的完整基因組文庫，載體容量提高10倍，達(dá)105-1010bp。在人類基因組計(jì)劃研究中發(fā)揮了重要作用。構(gòu)建過程：1、大片段DNA的獲?。禾崛∪旧wDNA、酶切、電泳、切割回收電泳條帶。2、YAC重組體的構(gòu)建：提取YAC質(zhì)粒、酶解、獲取YAC載體左右臂（帶選擇標(biāo)記）、與大片段DNA連接——YAC重組體。3、YAC重組體對(duì)酵母的轉(zhuǎn)化：4、YAC基因庫的鑒定：探針雜交、Southern轉(zhuǎn)移5、目的基因YAC克隆的篩選鑒定：PCR6、目的基因YAC克隆的鑒定：探針——目的基因某段序列。十八、愈傷組織及脫分化

愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上由外植體長(zhǎng)出來的一團(tuán)無序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞（細(xì)胞排列疏松、無規(guī)則）。

脫分化又稱去分化：已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞，當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時(shí)，已停止分裂的細(xì)胞，又重新恢復(fù)分裂，細(xì)胞改變?cè)械姆只癄顟B(tài)，失去原有結(jié)構(gòu)和功能，成為具有未分化特性的細(xì)胞。

十九、思考討論：為什么體內(nèi)細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織、器官？

基因在特定空間和時(shí)間條件下選擇性表達(dá)的結(jié)果。在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期，生物體不同部位的細(xì)胞表達(dá)的基因是不同的，合成的蛋白質(zhì)也不一樣，從而形成了不同的組織和器官。例1、在生物體內(nèi)，細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化為不同的組織、器官，是因?yàn)椋?/p>

A、細(xì)胞喪失了全能性

B、基因的表達(dá)有選擇性

C、不同的細(xì)胞內(nèi)基因不完全相同D、在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期，細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生了變化B二十、植物組織培養(yǎng)：是指用無菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長(zhǎng)和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)。具體就是：利用植物體的器官、組織或細(xì)胞，通過無菌操作接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在一定的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長(zhǎng)發(fā)育的技術(shù)。練習(xí)：1、為何已分化的細(xì)胞仍具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能？離體、提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素及其它適宜條件。體內(nèi)的細(xì)胞在特定的時(shí)間和空間條件下，基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。生物體的每一個(gè)細(xì)胞都含本物種的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成完整個(gè)體的全套基因。2、體內(nèi)的細(xì)胞為什么沒有表現(xiàn)出全能性，

而是分化成不同的組織器官？3、表現(xiàn)全能性的條件有哪些？下圖是植物組織培養(yǎng)的簡(jiǎn)略表示。據(jù)此回答：（1）①表示

，它能被培養(yǎng)成為④的根本原因是

。（2）②表示

，它與①相比分化程度

，全能性

。（3）若想制作人工種子，應(yīng)該選用（填編號(hào)）

。（4）若①是花藥，則④是

，繼續(xù)對(duì)其使用

處理可獲得

正常植株，該過程稱為

。（5）若①是胡蘿卜根尖細(xì)胞，則培養(yǎng)成的④的葉片的顏色是

，這說明根尖細(xì)胞

。離體的器官、組織或細(xì)胞植物細(xì)胞的全能性。愈傷組織低高③單倍體植株秋水仙素純合單倍體育種綠色含有葉綠體形成相關(guān)的基因反饋練習(xí)1.下列屬于組織培養(yǎng)的是：（）A.花粉培養(yǎng)成單倍體植株B.芽發(fā)育成枝條C.根尖分生區(qū)發(fā)育成成熟區(qū)D.未受精的卵發(fā)育成植株A2.在離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化形成愈傷組織的過程中，下列哪一項(xiàng)條件是不需要的（）A.消毒滅菌B.適宜的溫度C.充足的光照D.適宜的養(yǎng)料和激素C3.要將胡蘿卜韌皮部細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株，不需要（）A.具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞B.離體狀態(tài)C.導(dǎo)入外源基因D.一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素C4、有關(guān)全能性的表述中，不正確的是（）Ａ．受精卵在自然條件下能使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體，因此全能性最高Ｂ．生物體內(nèi)細(xì)胞由于分化全能性不能表達(dá)Ｃ．卵細(xì)胞和受精卵一樣，細(xì)胞未分化，全能性很高Ｄ．植物細(xì)胞離體培養(yǎng)在一定條件下能表現(xiàn)出全能性C5.下列植物細(xì)胞全能性最高的是（）

A.形成層細(xì)胞B.韌皮部細(xì)胞C.木質(zhì)部細(xì)胞D.葉肉細(xì)胞

6．下列細(xì)胞全能性最高的是（）

A．植物的卵細(xì)胞

B．植物的精子細(xì)胞

C．被子植物的受精卵

D．被子植物的的葉肉細(xì)胞AC

花藥培養(yǎng):將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)其花粉粒改變發(fā)育進(jìn)程，形成花粉胚或愈傷組織，進(jìn)而分化成苗的過程。（器官培養(yǎng)）花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng))：將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分化后再生成苗。（細(xì)胞培養(yǎng)）

二十一、花藥和花粉培養(yǎng)的概念

（花藥產(chǎn)生花粉）花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”。兩者的異同點(diǎn)培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)