凝膠過濾層析

第四章

凝膠過濾層析第一節(jié)凝膠層析的基本原理第二節(jié)

凝膠介質(zhì)的分類和性質(zhì)第三節(jié)凝膠層析的基本操作第四節(jié)應(yīng)用第一節(jié)凝膠層析的基本原理葡聚糖凝膠顆粒示意圖

概念

凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析、立體排阻層析、體積排阻層析，是利用具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、且呈珠狀顆粒的凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進(jìn)行有機(jī)溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動(dòng)相為有機(jī)溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。隨后這一技術(shù)得到不斷地完善和發(fā)展。凝膠層析是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，它具有設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。因此，廣泛用于蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時(shí)還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。原理1)相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙向前移動(dòng)，速度快而首先流出層析柱，因此流程較短；2)相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過程中，從一個(gè)膠?？紫哆M(jìn)入另一凝膠顆粒，移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱；3)中等大小的分子，在凝膠顆粒內(nèi)外均有分布，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。凝膠過濾原理示意圖

凝膠層析的幾個(gè)概念外水體積（Vo）：是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積（Vi）：是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積。基質(zhì)體積（Vg）：是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。柱床體積（Vt）：是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積（Ve）：樣品中某組分洗脫下來所需洗脫液的總體積。Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

計(jì)算法：Vt=1/4D2h測量法：Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

由于Ｖｇ非常小，可忽略不計(jì)，因此：Ｖt＝Ｖ０+ＶｉＶ０可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液，如藍(lán)色葡聚糖-2000；Ｖi可用硫酸銨等無吸附力的小分子物質(zhì)。分配系數(shù)Ｋav

分配系數(shù)是指某個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。對(duì)于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt－Vo)它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的長短粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對(duì)每一物質(zhì)為常數(shù)與柱的物理?xiàng)l件無關(guān)。（1）Ｋav=0時(shí),Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,全部分布于流動(dòng)相里,在固定相分布為0,而最先流出。（2）當(dāng)Ｋav=1時(shí),Ve=Vt,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動(dòng)相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.（3）當(dāng)0<Ｋav<1,Ve<

Vt為處于兩種極端行為之間的分子。（4）Ｋav>1現(xiàn)象說明凝膠對(duì)組分有吸附作用,此時(shí)Ve>Vt,例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值.

因此分子的正常Ｋav值0~1之間,這種由小到大的順序決定了物質(zhì)流出的順序。排阻極限：是指不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。

排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量。第二節(jié)

凝膠介質(zhì)的分類和性質(zhì)1）葡聚糖凝膠

①

G類葡聚糖（Sephadex）

②

LH-親脂型葡聚糖

③

Sephacryl2）瓊脂糖凝膠3）聚丙烯酰胺凝膠（1）葡聚糖凝膠①

G類葡聚糖（Sephadex）

由葡聚糖（右旋糖酐）和交聯(lián)劑以醚鍵交聯(lián)而成理化性質(zhì)1）型號(hào)不同，交聯(lián)度不同，膨脹度和吸水量不同，篩孔大小和分級(jí)范圍也不同；2）商業(yè)用的型號(hào)又G10、G15、G25，G100等，數(shù)字代表每g干凝膠吸水量×10，如G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升；3）數(shù)字越小，分級(jí)范圍窄，適合低分子量的蛋白質(zhì)的分離，數(shù)字越大，適合寬范圍分子量的分級(jí)4）穩(wěn)定性對(duì)堿比較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解5）吸附性對(duì)堿性蛋白有吸附作用，提高離子強(qiáng)度即可解決（含NaCl的緩沖液）

②LH-親脂型葡聚糖在有機(jī)溶劑中膨脹，可以分離脂肪酸、甘油脂、類固醇、維生素、激素類等親脂性分子的分離。洗脫劑可用單一有機(jī)溶劑如甲醇、氯仿等，也可用混合溶劑如氯仿與甲醇的混合液。

③Sephacryl

烯丙烷基葡聚糖和甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)而成。優(yōu)點(diǎn)1）分離范圍很大，排阻極限甚至可以達(dá)到108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sephadex的范圍。甚至可以分離較大的病毒顆粒。2）化學(xué)穩(wěn)定性更高：Sephacryl在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫。3）機(jī)械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，流速可以快些，分辨率也較高。

（2）瓊脂糖凝膠商品名Sepharose（瑞典）

1）2B,4B等型號(hào)，數(shù)字代表顆粒中瓊脂糖的百分含量，數(shù)字越大，分離的范圍越小

2）與1，3－二溴異丙醇反應(yīng)生成交聯(lián)瓊脂糖，穩(wěn)定性提高；Bio－gelA(美國）

一般有A0.5,A1.5等型號(hào)，數(shù)字×106代表分離的分子量極限；與葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠相比，瓊脂糖凝膠機(jī)械強(qiáng)度和篩孔穩(wěn)定性好，洗脫速度可以快些瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)

瓊脂糖凝膠（agarosegel）比葡聚糖凝膠和生物膠的排阻范圍大，可達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量108，使凝膠層析的分離區(qū)間擴(kuò)大到大分子和病毒顆粒；機(jī)械性能好。缺點(diǎn)穩(wěn)定性較葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠穩(wěn)定性差，不耐酸堿，最好將條件控制在pH4～9之間，溫度0～40℃，超出此范圍,可能被破壞。（3）聚丙烯酰胺凝膠商品名Bio－gel

與甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)，過硫酸銨為催化劑，TEMED加速劑。改變交聯(lián)劑的濃度，可以改變孔隙，交聯(lián)劑越多，孔隙越??；常用型號(hào)P-2和P－300，數(shù)字×103為分離的分子量極限聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-GelP-300為4×105

性質(zhì)

耐酸，pH1－10穩(wěn)定，耐受變性劑（尿素、胍鹽等）種類（商品名）商品型號(hào)型號(hào)中數(shù)字意義排阻限度穩(wěn)定性葡聚糖凝膠（Sephadex）G15，G25，G100…每g的吸水量(ml)×10數(shù)字越大，篩孔越大

6×105水、鹽、堿、弱酸中穩(wěn)定；對(duì)強(qiáng)酸敏感瓊脂糖凝膠（Sepharose）2B,4B,6B…顆粒中瓊脂糖的含量（％）；數(shù)字越大，篩孔越小

1×108

機(jī)械強(qiáng)度好，物理穩(wěn)定性高于葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠，但不耐酸堿（僅在ph4-9穩(wěn)定）瓊脂糖凝膠（Bio－gel）A0.5m，A5M…排阻極限*的10－6,數(shù)字越大，篩孔越大聚丙烯酰胺凝膠（Bio－gel）P-2,P-4,P-300…排阻極限*的10-3數(shù)字越大，篩孔越大

4×105耐受鹽、尿素、胍鹽，pH1－10穩(wěn)定，短時(shí)超過此范圍也可

幾種凝膠的比較第三節(jié)凝膠層析基本操作一、凝膠的選擇凝膠型號(hào)的選擇凝膠粒度的選擇不同凝膠類型的選擇凝膠用量的計(jì)算

組別分離，將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開。脫鹽就是一種組別分離。

其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。

分級(jí)分離，將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開。

策略是使在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。1）凝膠型號(hào)的選擇（根據(jù)分離的目的）

組別分離一般選用SephadexG-25或G-50(3*104Da)，脫鹽一般選用G25（1000-5000Da）。

分級(jí)分離一般選用排阻極限略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠。

2）粒度的選擇

目數(shù)（反映凝膠顆粒直徑的大小）。目數(shù)越大，直徑越小。每種型號(hào)凝膠都有有粗粒和細(xì)粒之分。細(xì)粒均一性好，分離效果好，但是流速慢，適合小型實(shí)驗(yàn)。層析柱選用大直徑的；粗粒的優(yōu)勢是流速快，適合樣品量大的實(shí)驗(yàn)，選用小直徑的柱子提高分辨率。

凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖3）不同凝膠類型的選擇瓊脂糖凝膠、Sephacryl

LH-葡聚糖凝膠瓊脂糖凝和Sephacryl大分子分離親脂分子規(guī)模大，流速快其他因素如洗脫液的酸堿度根據(jù)各種凝膠的性質(zhì)選擇4）凝膠用量的計(jì)算二、凝膠的處理將所用的干凝膠慢慢傾入5、10倍的蒸餾水中，參照凝膠說明書溶脹所需的時(shí)間進(jìn)行充分浸泡，并除去懸浮的小顆粒。再用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液在室溫下浸泡0.5h，抽濾除去堿液．用蒸餾水洗至中性。為了除去凝膠顆?？障吨械臍馀?，可把處理過的凝膠浸泡于蒸餾水或平衡液中用抽氣方法實(shí)現(xiàn)。三、凝膠柱的制備1）柱的選擇

長層析柱分辨效率高于短柱。理想的直徑和長度之比是1：25－1：100根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)。2）裝柱

干裝法容易產(chǎn)生氣泡濕裝法先將適量溶劑加到柱中，將浸泡好的凝膠緩慢倒入，一直浸泡在溶劑中，沉降至柱高1/4－1/3時(shí)打開下端出口，溶劑流出。3）鑒定柱的質(zhì)量

用帶色的物質(zhì)或蛋白質(zhì)過柱均勻下降即可。細(xì)胞色素c、血紅蛋白等物質(zhì)配成2mg/ml的溶液過柱。四、加樣加樣體積越小，分辨率越高。

兩種蛋白洗脫體積為VeA、VeB，兩種蛋白分離體積Vs（洗脫體積之差），Vs＝VeA-VeB,理論上，Vp(加入樣品體積）＝Vs時(shí)就能分離兩種蛋白質(zhì)Vp<Vs時(shí)效果好。樣品粘度的影響五、洗脫洗脫液：能溶解被洗脫物質(zhì)、不使其變性或失活為原則。一般都以單一緩沖液(如磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等)或者鹽溶液作為洗脫液。有時(shí)甚至也可以用蒸餾水作洗脫液。影響流速的因素洗脫液加在柱上的壓力凝膠交聯(lián)度凝膠顆粒大小

流速過低樣品橫向擴(kuò)散增大，峰變寬，分辨率降低，洗脫時(shí)間長流速過高洗脫峰重疊，柱壓增大，分離效果變差線性流速控制在2～10cm/h六、凝膠柱的再生和保存用低濃度的酸或堿按其預(yù)處理方法進(jìn)行，處理后重新裝柱即可再使用。第四節(jié)應(yīng)用脫鹽高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中含有的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。脫鹽時(shí)，選擇排阻極限小的凝膠適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15分離大分子物質(zhì)測定分子量用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析記錄每一種成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。LgMWVeve但是不適于以下情況

1）極端pH洗脫液

2）纖維狀蛋白

3）一些酶類如淀粉酶分子量不