蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶

第七章蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶17.1蛋白質(zhì)和新生肽鏈折疊的新概念DNARNA蛋白質(zhì)（新生肽鏈）新生肽鏈必須經(jīng)歷一系列極其復(fù)雜的加工過程，包括氨基酸殘基的化學(xué)修飾諸如二硫鍵的形成、糖基化作用、羥基化作用、磷酸化作用等?，F(xiàn)在已知的與翻譯同時(shí)進(jìn)行或在翻譯完成后進(jìn)行的化學(xué)修飾反應(yīng)已經(jīng)超過100種。新生肽鏈必須進(jìn)行折疊，才能形成一定的三維結(jié)構(gòu)。每一個(gè)新合成的多肽鏈都必須轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)特定的場(chǎng)所或者被分泌到細(xì)胞外區(qū)發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)運(yùn)往往需要經(jīng)過一次甚至多次的跨膜過程。完全折疊好的蛋白質(zhì)是不能跨越細(xì)胞膜的，因此如果折疊過早或過多，還要先去折疊，才能跨膜運(yùn)輸?shù)教囟ǖ陌l(fā)揮其生物功能的場(chǎng)所，再最終折疊成為功能蛋白。2多亞基蛋白還要進(jìn)行亞基的組裝。許多以前體形式合成的蛋白，如一些蛋白酶等還必須經(jīng)過水解除去前體分子中的原序列和前序列才能轉(zhuǎn)變成具有活性的酶分子新生肽只有折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，才能獲得特定的生物學(xué)功能，成熟為功能蛋白分子。新生肽的折疊不僅指肽鏈在空間的盤卷，而是包括廣義的新生肽鏈的整個(gè)成熟過程，包括化學(xué)修飾、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、亞基組裝、水解激活等。320世紀(jì)50年代Fraekel－Conral和Williams從煙草斑紋病毒分離的外殼蛋白和核糖核酸，在體外生理?xiàng)l件下重組得到有感染活力的病毒粒子。60年代C.B.Anfinsen

根據(jù)還原變性的牛胰核糖核酸酶在去除變性劑和還原劑后，不需要任何其他物質(zhì)的幫助，能夠自發(fā)的形成正確的4對(duì)二硫鍵，重新折疊成天然的三維結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)幾乎全部生物活性的實(shí)驗(yàn)，提出“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必須的全部信息”或者說“一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)”的著名論斷，為此Anfinsen獲得1972年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。這些經(jīng)典的工作開辟了近代蛋白質(zhì)折疊的研究，形成了蛋白質(zhì)折疊自組裝（self－assembly）的主導(dǎo)學(xué)說。4Anfinsen原理揭示了蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定蛋白質(zhì)分子在熱力學(xué)上穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的必然，但是沒有闡明蛋白質(zhì)折疊的全過程，還有些問題需要回答：一級(jí)結(jié)構(gòu)到底如何決定高級(jí)結(jié)構(gòu)？具有完整一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈又如何克服在動(dòng)力學(xué)上可能的能障，最終達(dá)到這個(gè)熱力學(xué)上最穩(wěn)定的狀態(tài)？是否存在像三聯(lián)遺傳密碼那樣的第二套密碼，即氨基酸序列決定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的所謂的“折疊密碼”？57.1.1蛋白質(zhì)折疊的研究按照Anfinsen原理，在理論上應(yīng)該可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)其相應(yīng)的“唯一”的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)具有重要的意義。近年來的研究表明蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)序變過程，實(shí)驗(yàn)的目的是通過捕捉蛋白質(zhì)折疊的中間狀態(tài)了解蛋白質(zhì)折疊的全過程。在研究牛與人的α－乳清蛋白酸變性、熱變性和在中等濃度鹽酸胍溶液中變性時(shí)的各種物理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在這些條件下都能形成一種彼此類似但又不同于天然分子的結(jié)構(gòu)，具有與天然蛋白不同的新的物理狀態(tài)—“熔球態(tài)”熔球態(tài)是蛋白質(zhì)折疊過程的中間態(tài)，與天然分子比較，雖然被動(dòng)性增加，不存在特定的牢固安排的側(cè)鏈基團(tuán)，但其結(jié)構(gòu)仍是緊密的，并且具有顯著的分子柔性，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量很高。6對(duì)大多數(shù)小分子量蛋白質(zhì)來說，變性的蛋白質(zhì)在沒有外力的情況下可以通過折疊達(dá)到天然狀態(tài)無序狀態(tài)的瓦解(疏水坍塌，collapse）和二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。重折疊一開始很快形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是處于不穩(wěn)定狀態(tài)。二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定階段多途徑折疊。不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的聯(lián)合和裝配方式不同，即通過多途徑導(dǎo)致從變性態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)走向天然態(tài)。通過穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的相互作用進(jìn)入天然態(tài)，是折疊的最后過程，比早期過程慢。在這一階段，側(cè)鏈被包裝在特定的位置，分子變得越來越緊密，成為有特定三維結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子7對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊，提出了幾種模型，比較典型的有框架模型（framework），擴(kuò)散－碰撞模型（diffusion－collision）和熔球態(tài)模型（moltenglobule）等等8成核/快速生長模型(Thenucleation/r

apidgrowthmodel)

伸展多肽鏈開始折疊時(shí),多肽鏈上先形成許多小的“核”(nuclcus),這些小核由8-18個(gè)氨基酸殘基組成,它們隨機(jī)波動(dòng),很不穩(wěn)定,多肽鏈的其它部分以“核”為模板,快速折疊“生長”,最終形成天然構(gòu)象,在這個(gè)模型中,成核階段(nucleation)是限速步驟。9拼圖模型(Thejigsawpuzziemodel)此模型的中心思想就是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進(jìn)行折疊,在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結(jié)構(gòu)越來越多,最終都能形成天然構(gòu)象,而且沿每條途徑的折疊速度都較快,與單一途徑折疊方式相比,多肽鏈速度較快,另一方面,外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會(huì)給單一折疊途徑造成較大的影響,而對(duì)具有多條途徑的折疊方式而言,這些變化可能給某條折疊途徑帶來影響,但不會(huì)影響另外的折疊途徑,因而不會(huì)從總體上干擾多肽鏈的折疊,除非這些因素造成的變化太大以致于從根本上影響多肽鏈的折疊。10擴(kuò)散-碰撞-締合模型(Thediffusion-collision-adhesionmodel)

多肽鏈在折疊起始階段迅速形成一些類天然結(jié)構(gòu)或稱“微結(jié)構(gòu)域”(micro-domain),如α-helices,β-strands等,這些結(jié)構(gòu)在伸展的多肽鏈中不穩(wěn)定,它們之間相互碰撞相互作用而結(jié)合在一起時(shí),這些“微結(jié)構(gòu)域”就穩(wěn)定下來,多肽鏈進(jìn)一步折疊形成天然構(gòu)象。11框架模型(Theframeworkmodel)

在多肽鏈折疊過程中,先迅速形成二級(jí)結(jié)構(gòu),這些二級(jí)結(jié)構(gòu)也是不穩(wěn)定的,稱為“flickeringcluster”,多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行組裝,形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。這個(gè)模型認(rèn)為即使是一個(gè)小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊,其間形成的亞結(jié)構(gòu)域(sub-domain)是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。12快速疏水折疊模型(Therapidhydropho-biccollapsemodel)

伸展多肽鏈處在極性的水溶液環(huán)境中,其疏水側(cè)鏈基團(tuán)為避開極性環(huán)境而導(dǎo)致多肽鏈快速折疊,形成“溶球體”(moltenglobule),然后再進(jìn)一步折疊形成天然構(gòu)象。13動(dòng)力學(xué)模型(Thekineticmodel)

多肽鏈折疊分為三個(gè)階段，在多肽鏈折疊的起始階段類似“拼圖模型”,多肽鏈沿多條途徑迅速形成許多具有一些局部結(jié)構(gòu)的中間體,折疊的中間階段類似“成核/快速生長模型”的快速生長階段,多肽鏈在第一階段形成的局部結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行快速折疊“生長”形成具有較多天然結(jié)構(gòu)的中間體,復(fù)性的最后階段是中間體向天然構(gòu)象的轉(zhuǎn)變,這是整個(gè)折疊過程中的限速步驟。14蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)模型U1-6:伸展多肽鏈I1-3:具有局部結(jié)構(gòu)的中間體I4:具有較多天然結(jié)構(gòu)的中間體NN:天然構(gòu)象15這些模型各有特點(diǎn),這與模型提出者們各自研究的對(duì)象及側(cè)重點(diǎn)不同有關(guān),它們之間有許多相似之處,如“框架模型”與“擴(kuò)散-碰撞-締合模型”中各自所指的“微結(jié)構(gòu)域”和“flickeringcluster”型“和”成核/快速生長模型”的一些觀點(diǎn)。Baldwin.R.L為在多肽鏈的始階段,“疏水折疊”和二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成(框架模型)就是互補(bǔ)的,它們?cè)诙嚯逆溦郫B的起始階段可以同時(shí)存在。因?yàn)樵凇叭芮蝮w”中就有大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)。16

除了這些折疊模型外,還有學(xué)者從另外的角度來考慮多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的問題,如Karplus等用MonteCarol法對(duì)200個(gè)隨機(jī)序列的折疊動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其中30種能快速折疊,而其中146種折疊速度很慢。他們認(rèn)為,在生物進(jìn)化過程中,自然界容易選擇那些能快速折疊而最終達(dá)到熱力學(xué)上穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的序列,而那些折疊緩慢的多肽鏈在生物體內(nèi)容易被蛋白酶降解而被自然界淘汰。17

另外,多肽鏈在體內(nèi)的快速折疊顯然是由生物體內(nèi)這個(gè)特殊的生理環(huán)境所決定的,折疊過程受到許多酶的催化,如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI),脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)等,分子伴侶在這個(gè)過程中也會(huì)起到重要作用,多肽鏈在體內(nèi)折疊還可能是伴隨著翻譯/轉(zhuǎn)移進(jìn)行的。Bergman,L.W.和Kuebl.W.M.發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白輕鏈的Cys35-Cys100這對(duì)天然二硫鍵是伴隨著多肽鏈的翻譯及向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移的過程中形成的，說明多肽鏈N端部分在翻譯還未完成時(shí)就可能開始折疊,這顯然也是多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的一個(gè)原因。18

以變性蛋白的重新折疊作為新生肽鏈翻譯完成后折疊的模型來研究新生肽鏈的折疊是建立在過去幾十年間在體外研究蛋白質(zhì)折疊基礎(chǔ)上的。長期以來普遍認(rèn)為細(xì)胞中新合成的多肽鏈?zhǔn)窃谄浜铣山K了之后，不需要?jiǎng)e的分子的幫助，也不需要額外能量的補(bǔ)充，就應(yīng)該能夠自發(fā)的折疊而形成它的三維結(jié)構(gòu)，是一個(gè)翻譯后的自發(fā)折疊過程。所以，是一條完整的但還不具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的新生肽鏈的自發(fā)折疊。19普遍的用天然蛋白先變性使其喪失高級(jí)結(jié)構(gòu)而成為伸展的肽鏈，再去除變性因素使其自發(fā)的重新折疊，即把變性蛋白的復(fù)性作為新生肽鏈折疊的模型。所以蛋白在試管內(nèi)的去折疊和重新折疊的研究一直是蛋白質(zhì)折疊研究的主體系統(tǒng)，也是研究新生肽鏈折疊的基本模型。20

鄒承魯在1988年提出了新生肽鏈折疊的假說，他認(rèn)為新生肽鏈的折疊在合成早期業(yè)已開始（取決于特定蛋白分子氨基端的氨基酸序列），而不是合成完成后才開始進(jìn)行的；隨著肽鏈延伸同時(shí)進(jìn)行折疊，又不斷進(jìn)行構(gòu)象的調(diào)整；先形成的結(jié)構(gòu)會(huì)作為后合成的肽鏈的折疊，而后形成的結(jié)構(gòu)又會(huì)影響前面已經(jīng)形成的結(jié)構(gòu)的調(diào)整，因此在肽鏈的延伸過程中形成的結(jié)構(gòu)往往不一定是最終功能蛋白中的結(jié)構(gòu)。這樣新生肽鏈的合成、延伸、折疊、構(gòu)象調(diào)整，直到最終三維結(jié)構(gòu)的形成，是一個(gè)同時(shí)進(jìn)行著的、協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過程。顯然這與一條變性伸展的完整肽鏈的重折疊的情況是完全不同的。21

新生肽鏈邊合成邊折疊邊調(diào)整的假說，將國際上有關(guān)新生肽鏈折疊的多種看法統(tǒng)一起來，強(qiáng)調(diào)了新生肽鏈折疊的結(jié)構(gòu)信息存在于組成多肽鏈的氨基酸序列中，既考慮到多肽鏈中特定氨基酸殘基間的近程相互作用，又重視特定氨基酸殘基的遠(yuǎn)程相互作用在新生肽鏈折疊中的重要貢獻(xiàn)。22新生肽鏈在合成過程中一直與核糖體相連，并且每種肽鏈在核糖體上的衍射是不同步的。每個(gè)mRNA可以同時(shí)攜帶多個(gè)核糖體，因此也帶著多個(gè)處于不同合成階段的、長度不同的新生肽鏈。我們現(xiàn)在還沒有有效的手段來探測(cè)肽鏈在核糖體上的折疊過程。多肽鏈在核糖體上合成同步化等問題尚未解決之前，鄒承魯實(shí)驗(yàn)室提出用從N端開始具有不同長度的一系列肽段做模型，比較研究它們的構(gòu)象變化和折疊規(guī)律。23二維及多維核磁共振為進(jìn)一步研究新生肽鏈的折疊過程提供了精確的定量和定位方法。已有的結(jié)果表明，核糖體上的肽段的二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量并不總是隨著肽鏈的延長而增加，說明后形成的肽段對(duì)先行成的肽段的構(gòu)象確實(shí)有影響，肽段的結(jié)構(gòu)一直處于調(diào)整之中。24將多肽鏈延伸過程中構(gòu)象的形成和生物活性的表達(dá)一起考慮時(shí)，即可進(jìn)一步闡明在新生肽鏈延伸過程中構(gòu)象的形成和活力出現(xiàn)之間的關(guān)系。對(duì)不同長度的肽段的去折疊和重新折疊特性以及它們同其特定配體結(jié)合特性的研究，可以進(jìn)一步探明肽段的延伸和多肽鏈上特定氨基酸殘基之間相互作用的關(guān)系以及對(duì)生物活性的貢獻(xiàn)。利用構(gòu)象特異的單克隆抗體與不同長度的肽段之間相互作用的特性，也可以探測(cè)多肽鏈延伸過程中其特定構(gòu)象形成的過程。25以核酸酶為例實(shí)驗(yàn)研究表明，肽鏈上作為抗原決定簇的特定區(qū)域在核酸酶折疊的早期已經(jīng)出現(xiàn)，此時(shí)肽鏈的β－折疊結(jié)構(gòu)含量低。隨著肽鏈的繼續(xù)延伸，較長片段的β折疊結(jié)構(gòu)含量顯著提高，此時(shí)與構(gòu)象特異性單克隆抗體的結(jié)合能力顯著降低，這是由于與較短片段相比，較長的片段具有更多的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)較為緊密，符合前熔球態(tài)的結(jié)構(gòu)特性。更長的肽鏈則具有更為豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別為熔球態(tài)，后熔球態(tài)和類天然態(tài)，在這些較長片段中抗原決定簇被部分包埋或屏蔽，導(dǎo)致抗體不易接近。26當(dāng)整條肽鏈的合成完成后，肽鏈的β－結(jié)構(gòu)含量表現(xiàn)為最高，而它與構(gòu)象特異的單克隆抗體的結(jié)合能力表現(xiàn)為最低，這表明肽鏈上作為抗原決定簇的特定區(qū)域在蛋白折疊完成后，已較少暴露在該蛋白的表面，同時(shí)也說明在由類天然態(tài)蛋白延伸到天然蛋白的過程中，肽段構(gòu)象仍有較明顯的變化上述結(jié)果充分說明核酸酶在肽鏈延伸直至形成完整的功能蛋白的過程中經(jīng)歷了多次構(gòu)象調(diào)整。27對(duì)同一種蛋白質(zhì)的不同長度的N端肽段的結(jié)構(gòu)與功能表達(dá)關(guān)系的研究為了解新生肽鏈的折疊機(jī)制提供了很多有意義的結(jié)果和佐證，但畢竟是在離體條件下研究新生肽鏈折疊的模型體系。進(jìn)一步探索新生肽鏈在核糖體上折疊的設(shè)計(jì)相繼問世，如將構(gòu)象特異性的單克隆抗體作為探針，探測(cè)肽鏈在核糖體上延伸過程中的構(gòu)象變化過程。另一種辦法是將體外轉(zhuǎn)錄與體外翻譯相結(jié)合，設(shè)計(jì)各種探針來追蹤體外翻譯體系中酶蛋白活性表達(dá)過程來探測(cè)新生肽鏈在核糖體上的折疊過程。287.1.2體外蛋白質(zhì)重折疊與細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊的差別完整肽鏈在試管內(nèi)的重新折疊相當(dāng)于翻譯完成后才折疊；細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈的合成延伸與折疊同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊是一個(gè)比蛋白質(zhì)體外重折疊快得多的過程。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溫度大約在37℃附近，pH值一般在中性范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)復(fù)性如果在體外這樣的條件下進(jìn)行，通常會(huì)形成大量的聚集物，活性蛋白的回收率多半是極低的。為了得到高產(chǎn)率的復(fù)性，往往降低溫度到4℃，復(fù)性蛋白的濃度也很低，通常大約在1mg/ml。針對(duì)不同的蛋白，體外折疊所選用的pH值范圍也很不同。29細(xì)胞中存在著成千上萬種生物大分子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)所有大分子的濃度估計(jì)可高達(dá)50-400mg/ml，因此，細(xì)胞容積的10－40％都被大分子占用。如，根據(jù)生長期的不同，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)和RNA的總濃度約在300-400mg/mL范圍內(nèi)。由于大分子的不可穿透性使得任何一個(gè)大分子的實(shí)際可使用空間大大減小，這樣生物大分子活動(dòng)環(huán)境被稱為“大分子擁擠環(huán)境”它對(duì)生物大分子行為的影響描述為“排斥容積效應(yīng)”（excludedvolumeeffect），強(qiáng)調(diào)的是源于空間排斥的純物理的非特異性效應(yīng)，因此把研究的大分子以外的其他大分子成為背景大分子（backgroundmacromolecules）。而且大分子擁擠環(huán)境在細(xì)胞外也是存在的。30大分子擁擠最早是在理論上進(jìn)行研究的，NIH的A.P.Minton從1983年就開始研究大分子擁擠現(xiàn)象，從理論上預(yù)測(cè)這樣一個(gè)大分子擁擠環(huán)境對(duì)所有大分子之間的反應(yīng)都有很大的影響，不僅反應(yīng)的速率而且影響反應(yīng)的平衡。最近Warwick大學(xué)的R.J.Ellis教授指出，生物學(xué)家們?cè)谘芯矿w系中一定要加入細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)濃度的“擁擠試劑”（crowdingagent）以模擬細(xì)胞內(nèi)的大分子擁擠環(huán)境；要把大分子擁擠與pH、離子強(qiáng)度和溶液組成等一樣視為常規(guī)因素考慮在蛋白質(zhì)折疊的研究中。31近期以來,體外模擬大分子擁擠對(duì)蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)的平衡及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究較多。Zimmerman和Minton建立了不同的反應(yīng)模型系統(tǒng),通過系統(tǒng)反應(yīng)測(cè)試大分子擁擠環(huán)境對(duì)反應(yīng)速率和反應(yīng)平衡的影響。結(jié)果表明,加入大分子擁擠試劑后,不僅加快了反應(yīng)速率,而且使得平衡向著結(jié)合的方向移動(dòng)。已占體積理論認(rèn)為,高濃度的惰性大分子可以鞏固穩(wěn)定致密的蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。A.P.Minton建立了一個(gè)更為詳細(xì)的模型以解釋這種效應(yīng)—提高惰性大分子的濃度,可以降低解折疊多肽鏈的含量并最終導(dǎo)致平衡向著形成蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的方向移動(dòng)。32當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加,擁擠效應(yīng)對(duì)活性系數(shù)的影響遠(yuǎn)比對(duì)濃度的影響要大的多。A.P.Minton于1983年就發(fā)現(xiàn),將血紅蛋白的濃度從20g/L升高到30g/L時(shí),其活性系數(shù)增加了10倍。同時(shí),擁擠效應(yīng)對(duì)活性系數(shù)的影響還和參與的蛋白質(zhì)的構(gòu)型熵有關(guān),擁擠環(huán)境限制了蛋白質(zhì)相互反應(yīng)過程中的構(gòu)象變化。已占體積效應(yīng)可以很好的解釋在擁擠環(huán)境條件下的蛋白質(zhì)折疊過程中的同源聚合反應(yīng)和異源聚合反應(yīng)。Ralston和Cole通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),給反應(yīng)體系中加入聚蔗糖Dextran或聚乙二醇PEG,可促進(jìn)血影蛋白從其二聚體形式向四聚體形式轉(zhuǎn)變。Linder和Ralston也發(fā)現(xiàn)血影蛋白二聚體與四聚體之間的平衡受到了擁擠的影響,擁擠增加了締合速率常數(shù)。1999年,Rivas等人發(fā)現(xiàn),在高濃度的牛血清白蛋白BSA溶液中(>40g/L),血纖維蛋白原單體(其與BSA之間不會(huì)發(fā)生異源聚合)傾向于形成二聚體甚至形成更大的寡聚蛋白。33然而,擁擠也會(huì)引起部分折疊蛋白質(zhì)之間的相互聚合從而降低了部分折疊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成為天然功能蛋白質(zhì)的數(shù)量。VandenBerg等人關(guān)于大分子擁擠對(duì)蛋白質(zhì)折疊的影響的報(bào)道認(rèn)為,擁擠體系加強(qiáng)了非天然蛋白質(zhì)之間的聚合程度。在大分子擁擠環(huán)境中,和已占體積效應(yīng)對(duì)非天然蛋白質(zhì)命運(yùn)的決定影響力相比,蛋白質(zhì)與擁擠試劑之間的異源聚合反應(yīng)在蛋白質(zhì)的再折疊過程中發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)采用的復(fù)性緩沖體系含有300g/L的擁擠大分子,擁擠大分子分別采用聚蔗糖Dextran70,葡聚糖Ficoll70,牛血清白蛋白BSA。以還原型溶菌酶作為測(cè)試對(duì)象,分別測(cè)定其在不同擁擠試劑條件下的復(fù)性產(chǎn)率,得到的結(jié)果表明復(fù)性產(chǎn)率顯著降低。34通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分別以多糖和蛋白質(zhì)作為擁擠試劑,結(jié)果有很大的區(qū)別:蛋白質(zhì)BSA的影響要比多糖Dextran70及Ficoll70的影響嚴(yán)重的多。盡管BSA,Ficoll70,Dextran70有著近似的分子量,但是,它們?cè)诰彌_體系中所引起的對(duì)還原型溶菌酶的排阻體積效應(yīng)很可能不同。BSA為球型的蛋白質(zhì),而Ficoll70或Dextran70為無交聯(lián)結(jié)構(gòu)或部分交聯(lián)結(jié)構(gòu)。其次,BSA具有17對(duì)二硫鍵,那么在完全還原的溶菌酶的再折疊過程中,BSA可能會(huì)和還原型溶菌酶上的巰基形成錯(cuò)配的分子間二硫鍵。BSA和溶菌酶形成的中間體的結(jié)構(gòu)仍然還是未知,但是溶菌酶是一個(gè)堿性蛋白質(zhì),很容易和酸性的蛋白質(zhì)如BSA發(fā)生反應(yīng)。35總之，大分子擁擠是普遍存在的,各種類型的細(xì)胞中都有發(fā)生。所以有機(jī)體進(jìn)化了機(jī)理以保證新合成的多肽鏈在高度擁擠的環(huán)境中能夠正確折疊。一方面,分子伴侶和折疊酶可以幫助多肽鏈在高度擁擠的環(huán)境中正確折疊;另一方面,多肽鏈本身具有折疊信息以應(yīng)對(duì)大分子擁擠。不同的蛋白多肽鏈獲得不同的應(yīng)對(duì)高度擁擠環(huán)境的能力。367.1.3蛋白質(zhì)折疊研究的新概念20世紀(jì)80年代后期，分子伴侶（molecularchaperone）的發(fā)現(xiàn)使新生肽鏈自發(fā)折疊和組裝的傳統(tǒng)概念發(fā)生了很大的變化。現(xiàn)在認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈折疊和成熟為功能蛋白，一般說來是需要幫助的，而不都是能自發(fā)進(jìn)行并完成的。該觀點(diǎn)在動(dòng)力學(xué)的意義上有所發(fā)展，加深和完善了蛋白質(zhì)折疊的學(xué)說。如果一級(jí)結(jié)構(gòu)是肽鏈折疊形成功能蛋白質(zhì)的特定三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)因是第一要素；那么幫助蛋白質(zhì)肽鏈正確折疊的外因是條件，外因要過內(nèi)因起作用；但如果沒有適當(dāng)?shù)某浞值臈l件，多肽鏈也不能折疊成為活性蛋白質(zhì)。377.2幫助蛋白質(zhì)和新生肽鏈折疊的生物大分子幫助新生肽折疊的是蛋白質(zhì)，它可以分為兩大類：分子伴侶催化與折疊直接有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)的酶－“折疊酶”，目前已確定的幫助蛋白質(zhì)折疊的酶只有兩個(gè)，一個(gè)是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（proteindisulfideisomerase，PDI）；另一個(gè)是肽基脯氨酸酰順反異構(gòu)酶（peptidy

prolyl

cis－transisomerase，PPI）。它們都催化共價(jià)的異構(gòu)反應(yīng)。387.2.1分子伴侶（molecularchaperone）1978年Laskey發(fā)現(xiàn)，必需要在一種核內(nèi)酸性蛋白nucleoplasmin存在時(shí)，組蛋白和DNA在體外生理離子強(qiáng)度條件下才能組裝成核小體，否則就會(huì)發(fā)生沉淀。Laskey給幫助核小體組裝的蛋白起名“molecularchaperone”。后來Ellis在研究高等植物葉綠體中的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶－加氧酶（Rubisco）時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。在葉綠體中合成的8個(gè)大亞基核在細(xì)胞質(zhì)中合成的8個(gè)小亞基都必須先和一種蛋白結(jié)合后，才能在葉綠體內(nèi)組裝成活性酶分子。因此，1987年Ellis證實(shí)提出在普遍意義上幫助新生肽鏈折疊的“molecularchaperone”的概念。39經(jīng)幾度修正，1997年Ellis對(duì)“分子伴侶”的定義是：Alargeanddiversegroupofunrelatedproteinsthatallsharethefunctionalpropertyofassistingthenoncovalentassemblyand/ordisassemblyofprotein-containingstructureinvivo,butarenotpermanentcomponentsofthesestructureswhentheyareperformingtheirnormalbiologicalfunctions.即一大類相互之間沒有關(guān)系的蛋白質(zhì)，它們具有的共同功能是幫助其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在體內(nèi)進(jìn)行非共價(jià)的組裝和卸裝，但不是這些結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能時(shí)的永久的組成成分。分子伴侶完全是從功能上定義的。40從參與促進(jìn)一個(gè)反應(yīng)而自身并不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點(diǎn)來看，分子伴侶具有酶的特征。酶與分子伴侶的不同表現(xiàn)在如下三個(gè)方面：

1.分子伴侶對(duì)靶蛋白布局有高度專一性，同一分子伴侶可以促進(jìn)多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成三維結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都并不相關(guān)的蛋白質(zhì)

2.分子伴侶的催化效率很低

3.分子伴侶和肽鏈折疊的關(guān)系，有時(shí)也只是阻止肽鏈的錯(cuò)誤折疊，而不是促進(jìn)其正確折疊成為成熟的有完整功能的蛋白質(zhì)41已經(jīng)鑒定的部分分子伴侶4243分子伴侶幫助正確的“非共價(jià)組裝或卸裝”強(qiáng)調(diào)“非共價(jià)”是為了區(qū)分和排除那些催化新生肽進(jìn)行翻譯后共價(jià)修飾的酶。Ellis在1993年年時(shí)曾明確指出：“蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶不是分子伴侶”。王志珍等對(duì)此持有不同的看法：提出了一個(gè)假說“蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶既是酶又是分子伴侶”。并且提供了充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶確實(shí)具有固有的，在一般意義上的分子伴侶活性，進(jìn)一步又證明蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶作為折疊酶的作用是由異構(gòu)酶活性和分子伴侶活性二者共同組成的。44伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過程hsp60hsp60hsp6045用“組裝”這個(gè)詞，是因?yàn)榉肿影閭H的功能不僅幫助新生肽鏈折疊，還幫助新生肽成熟為活性蛋白的各個(gè)步驟，包括轉(zhuǎn)運(yùn)，跨膜定位，亞基組裝以及激活等，因此用廣義的“組裝”比較妥當(dāng)，由于新生肽鏈越膜有時(shí)需要解折疊，錯(cuò)誤折疊的肽鏈由蛋白水解酶清除前也需解折疊，分子伴侶還有幫助卸組裝的作用。另外，分子伴侶的作用還涉及許多其他正常的生命活動(dòng)，如DNA復(fù)制；細(xì)胞受到外界刺激（高溫、缺氧、有害化學(xué)因素、異常代謝物積聚、極端pH等)后的應(yīng)激反應(yīng)。46蛋白質(zhì)分子折疊的特點(diǎn)和分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊中的作用蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，除了共價(jià)的肽鍵和二硫鍵，還靠大量極其復(fù)雜的弱次級(jí)鍵的共同作用形成的?，F(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，變性蛋白的復(fù)性或新生肽鏈的成熟，不是一步形成的，而是通過形成一些折疊中間物而完成的。特別是新生肽鏈在逐漸延長過程中序列的不完整性使這些折疊中間物有可能形成在最終成熟蛋白分子中不存在而且不應(yīng)該有的瞬間結(jié)構(gòu)。它們常常是一些疏水性的表面。這些瞬間形成的錯(cuò)誤表面之間就有可能發(fā)生本來不應(yīng)該發(fā)生的錯(cuò)誤的相互作用而形成沒有活性的分子，特別是在擁擠的細(xì)胞環(huán)境中，甚至?xí)斐煞肿拥木奂统恋怼?748蛋白質(zhì)分子具有分子伴侶功能的先決條件是具有與多肽結(jié)合的能力。分子伴侶的作用機(jī)制實(shí)際上就是它如何識(shí)別需要幫助的靶蛋白，怎樣與其結(jié)合，結(jié)合后二者發(fā)生什么變化，在什么條件下解離，解離后二者的命運(yùn)又如何這樣一個(gè)全過程的機(jī)制？現(xiàn)在還認(rèn)識(shí)得很少。對(duì)分子伴侶作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)由于1994年細(xì)菌的GroEL的2.8×10-10m高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的解析而有所突破?，F(xiàn)在只知道分子伴侶識(shí)別折疊過程中形成的折疊中間物的非天然構(gòu)象，而不會(huì)去理會(huì)天然的結(jié)構(gòu)。一般而言，分子伴侶不是識(shí)別特定的多肽序列。到底非天然結(jié)構(gòu)的什么特征能被分子伴侶認(rèn)識(shí)還很不清楚。49由于在天然分子中，疏水殘基多半位于分子的內(nèi)部而形成疏水核，去折疊后就可能暴露出來，或者在新生肽鏈的折疊過程中，會(huì)暫時(shí)形成在天然構(gòu)象中本應(yīng)存在于分子內(nèi)部的疏水殘基組成的表面，因此認(rèn)為分子伴侶最有可能是與疏水表面相結(jié)合。在許多情況下，發(fā)現(xiàn)被分子伴侶結(jié)合的靶蛋白是處于所謂的“熔球體”結(jié)構(gòu)即分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)部分破壞但二級(jí)結(jié)構(gòu)仍然基本保存，因此整體結(jié)構(gòu)表面看來尚還緊密實(shí)際上已經(jīng)松散的一種狀態(tài)。一般來說，分子伴侶與折疊早期形成的中間物相互作用而防止它們之間的聚合；一旦聚合已經(jīng)形成，分子伴侶就無能為力了。50在活細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常存在一種所謂級(jí)連機(jī)制，即一個(gè)新生肽鏈的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝需要處于其成熟通道上不同部位的不同分子伴侶分級(jí)連續(xù)協(xié)同作用才能完成。比如在原核生物的核糖體上就有觸發(fā)因子（triggerfactor），古細(xì)菌可能與真核生物相似。在核糖體上有新生肽鏈結(jié)合復(fù)合體（nascentchain－associatedcomplex）和prefolding防止尚未離開核糖體的新生肽鏈發(fā)生聚集。新生肽鏈從核糖體脫落下來后，在胞質(zhì)內(nèi)則可得到DnaJ-DnaK-GrpE的幫助,進(jìn)一步還可得到GroEL或TriC家族的幫助而最終完成折疊。51分子伴侶還有一個(gè)非常重要的功能是與一些依賴ATP的蛋白水解酶一起,負(fù)責(zé)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行“質(zhì)量控制”即對(duì)正在折疊的肽鏈或折疊好的蛋白質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控,把折疊錯(cuò)誤的或因各種刺激損傷的無可救藥的蛋白由蛋白水解酶清除，以防止垃圾堆積而引起疾病。有趣的是這些負(fù)責(zé)清除無活性的蛋白垃圾的蛋白水解酶本身也具有固有的分子伴侶的活性（有的分子伴侶構(gòu)成蛋白水解酶的亞基），所以這種蛋白水解酶發(fā)揮作用的前期可能就是利用分子伴侶活性識(shí)別應(yīng)該被降解的對(duì)象，并使蛋白處于可溶狀態(tài)而容易被蛋白水解酶作用。與水解作用相聯(lián)的分子伴侶活性又稱charonins，主要有3個(gè)家族Clp

家族、AAA蛋白水解酶，如FtsH和Lon蛋白水解酶。52“質(zhì)量控制”最重要的問題是分子伴侶如何識(shí)別，如何正確分配？哪些還能夠繼續(xù)折疊？哪些已沒有希望繼續(xù)折疊而必須被水解清除的？有一種所謂的“動(dòng)態(tài)分配”觀點(diǎn)認(rèn)為“非天然構(gòu)象的肽鏈”無論是正在折疊的肽鏈或受損傷的肽鏈，可以與體系中的分子伴侶或有分子伴侶活性的蛋白水解酶相互作用而被進(jìn)一步正確折疊或被水解，它也可能因逃逸這兩種作用而發(fā)生自聚集。其最終命運(yùn)則取決于這幾種反應(yīng)的相對(duì)速度。537.2.2蛋白質(zhì)的聚集近年來，發(fā)現(xiàn)了一些與當(dāng)今人類健康和安全密切有關(guān)的疾病，如瘋牛病，Alzheimer’s（早老癡呆癥)、huntington氏癥、Parkinson氏癥等神經(jīng)退行性疾病，是由于蛋白質(zhì)形成聚集，并在特定器官中形成淀粉樣纖維沉淀或斑塊。因此蛋白質(zhì)聚集，錯(cuò)誤折疊的產(chǎn)物，反而成為蛋白質(zhì)折疊研究中極其熱門的重要的內(nèi)容，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大概有20多種蛋白，包括Prion

蛋白、β-淀粉樣蛋白Serpins、脂蛋白AI等，形成與這些疾病有關(guān)的淀粉樣沉淀。54最近，在蛋白質(zhì)聚集研究中的一個(gè)重要進(jìn)展是劍橋大學(xué)的Dobson教授發(fā)現(xiàn)，與上述這些形成淀粉樣纖維沉淀疾病無關(guān)的蛋白質(zhì)在體外一定的條件下也能聚集而形成淀粉樣纖維，這種由“普通”蛋白形成的淀粉樣纖維與疾病中發(fā)現(xiàn)的淀粉樣沉淀完全一樣而不可區(qū)分。因此他們認(rèn)為聚集是蛋白質(zhì)多肽鏈的一個(gè)普遍性質(zhì)，而不只是少數(shù)已確定引起有淀粉樣纖維沉積的疾病的蛋白所特有，進(jìn)一步他們通過對(duì)細(xì)胞功能損傷的測(cè)試指出，即使對(duì)非致病蛋白而言，其早期的聚集產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞都是有極大毒性的，而那些已經(jīng)成熟的、形成了高度有序的淀粉樣沉淀倒對(duì)細(xì)胞基本上無害了。這些重要進(jìn)展使人們對(duì)蛋白質(zhì)聚集的認(rèn)識(shí)提高了一大步。55蛋白聚集體的結(jié)構(gòu)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展要比蛋白的種類和一級(jí)序列更為重要?，F(xiàn)在對(duì)這類疾病冠以各種名稱“構(gòu)象病”、“淀粉樣纖維沉積病”、“折疊病”等等，其本質(zhì)都是蛋白質(zhì)的聚集。蛋白質(zhì)聚集不僅如以前認(rèn)為的只是喪失了蛋白的功能，其本身還對(duì)細(xì)胞有固有的毒性。因此在蛋白質(zhì)生物合成的分子水平上防止蛋白聚集，提高正確折疊效率，挽救錯(cuò)誤折疊的蛋白，對(duì)維持細(xì)胞正常功能是極其重要的。生物進(jìn)化必然會(huì)造就相應(yīng)的機(jī)制來保證蛋白質(zhì)折疊的高效率，那就是分子伴侶、催化與泛素結(jié)合的酶系統(tǒng)以及蛋白水解酶，它們的協(xié)同作用保證長期正常的生命活動(dòng)。567.2.3分子伴侶概念的推廣從Ellis于1987年提出“分子伴侶”的新概念并予以定義以來，分子伴侶的范圍實(shí)際上一直在擴(kuò)展而不拘泥于最早的定義。首先，分子伴侶不再局限于蛋白質(zhì)（包括酶）；核糖體，RNA，甚至一些磷脂（lipochaperone）都被鑒定為有分子伴侶的活性。有一類蛋白穩(wěn)定劑（如甘油和其他多元醇）它不提供結(jié)構(gòu)信息，可能是通過增加蛋白的水化作用而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)從而提高折疊的效率也被稱為“化學(xué)分子伴侶”。細(xì)胞中有一類有機(jī)小分子稱為“細(xì)胞滲透物”（cellularosmolytes）幫助細(xì)胞對(duì)付諸如高滲那樣的應(yīng)激，也起著化學(xué)分子伴侶的作用。實(shí)際上，人們?cè)谘芯堪w的復(fù)性時(shí)常常用到“化學(xué)分子伴侶”。57分子伴侶幫助的對(duì)象也不局限于蛋白質(zhì)，分子伴侶也可幫助其他生物大分子的折疊。與DNA結(jié)合、幫助DNA分子進(jìn)行預(yù)折疊或預(yù)扭曲，從而把DNA穩(wěn)定在一個(gè)適合于和蛋白結(jié)合的特定構(gòu)象,幫助DNA折疊的稱“DNA分子伴侶”。最近還發(fā)現(xiàn)RNA分子伴侶，即幫助RNA分子折疊的蛋白質(zhì)。RNA無論是其本身的加工、剪接和成熟，還是發(fā)揮各種生物功能，都與蛋白質(zhì)的相互作用密切相關(guān)，都需要有一定的構(gòu)象。

RNA折疊存在兩個(gè)基本問題：(1)在折疊過程中很容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊(2)它的三級(jí)結(jié)構(gòu)不是非常穩(wěn)定,很難確切描述。一些RNA結(jié)合蛋白與其結(jié)合后可以防止RNA的錯(cuò)誤折疊,或消除它的錯(cuò)誤折疊從而促進(jìn)RNA正確折疊成為功能結(jié)構(gòu)，或把RNA穩(wěn)定在正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)中。現(xiàn)在已經(jīng)鑒定到許多蛋白，如核糖核蛋白、核蛋白殼以及依賴RNA的ATP酶,都具有RNA分子伴侶的活性。58分子伴侶一定不是最終組裝完成的結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其生物學(xué)作用時(shí)的組成部分，但不一定必須是一個(gè)分離的實(shí)體，它可以是共價(jià)地卻是暫時(shí)地結(jié)合在靶蛋白上。因此一些蛋白水解酶的前導(dǎo)肽序列以及一些核糖體前體蛋白的泛肽尾，若有分子伴侶功能的也不排除在外，見下表。

59前導(dǎo)肽對(duì)于這些酶的折疊和成熟是必需的，稱為分子內(nèi)分子伴侶（Intramolecularchaperone）。這些處于信號(hào)肽和成熟蛋白之間的前導(dǎo)肽，不僅抑制酶原蛋白的活力，現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到它們還有新的功能，即作為分子伴侶幫助酶原蛋白折疊。與一般的分子伴侶相比，這種分子內(nèi)分子伴侶具有高度的專一性。通過不需要ATP的自水解作用釋放。通常分子伴侶對(duì)其幫助對(duì)象是不提供三維結(jié)構(gòu)信息。但枯草桿菌蛋白酶的分子內(nèi)分子伴侶似乎對(duì)其酶蛋白的折疊提供了結(jié)構(gòu)信息。607.2.4分子伴侶的分類1.伴侶素家族(Charperon

in,Cpn)

Cpn

家族具有獨(dú)特的雙層7-9元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡聚蛋白(Hemm

inngwen;cheng1998),它們以依賴ATP方式促進(jìn)體內(nèi)正常和應(yīng)急條件下蛋白質(zhì)折疊。Cpns

又可分為兩組:GroEl(Hsp60)家族和Tric

家族。GroEl

的Cpn

由雙層7個(gè)亞基形成圓環(huán)組成,每個(gè)亞基分子量約為60ku。它們?cè)隗w內(nèi)與一種輔助因子,如E.coli

中的GroES,協(xié)同作用幫助蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)一般是應(yīng)急反應(yīng)誘導(dǎo)的,人們對(duì)GroE

和GroES的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)理作了詳細(xì)研究。Tric

型的Cpn

是由雙層8或9元組成,亞基分子量約為55k。該種Cpn

沒有類似的輔助因子。61GroELGroEL的結(jié)構(gòu)

GroEL

蛋白是同型寡聚復(fù)合物,由14個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量58×103

的亞基組成,形成兩層垛疊的背靠背雙環(huán)組成的中空?qǐng)A柱結(jié)構(gòu),每個(gè)環(huán)由7個(gè)亞基組成。晶體學(xué)研究表明,GroEL

每個(gè)亞基由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:頂端結(jié)構(gòu)域(apicalregion)位于圓柱兩端的頂端開口處,是底物和其輔助分子伴侶(cochaperonin)的結(jié)合位點(diǎn);赤道結(jié)構(gòu)域(equatorialdomain)包括ATP結(jié)合位點(diǎn)及大部分內(nèi)環(huán)和外環(huán)的接觸點(diǎn),有微弱的ATP酶活性;鉸鏈結(jié)構(gòu)域(hingedomain)是和別的結(jié)構(gòu)域相連的地方,并在頂端結(jié)構(gòu)域和赤道結(jié)構(gòu)域間傳遞構(gòu)象變化。在GroEL

的中央空腔中可結(jié)合多種非天然的多肽(nonnativepolypeptide),底物結(jié)合主要靠非天然多肽暴露的疏水側(cè)鏈和GroEL頂端結(jié)構(gòu)域的疏水殘基相互作用。GroEL

單獨(dú)可以幫助某些底物折疊。62GroEl63同時(shí)使多肽也有機(jī)會(huì)離開GroEL

復(fù)合體,釋放的多肽或者發(fā)生了去折疊,或者已經(jīng)折疊,或重新結(jié)合相同或不同的GroEL

復(fù)合體,這樣再結(jié)合可能誘導(dǎo)錯(cuò)誤折疊的多肽發(fā)生去折疊,最終保證了多肽的正確折疊。一般來說,GroEL

介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊需要GroES的協(xié)助。GroES

是由相對(duì)分子質(zhì)量為10×103

的亞基組成的單一七聚體環(huán),并連在GroEL

的末端。64GroEL

的功能

在新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝以及變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過程中起重要作用。就GroEL-GroES

介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊,Jue等提出了兩種在新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝以及變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過程中起重要作用模型:①膠囊化模型(encapsulationmodel):在多核苷酸存在的情況下,GroES

可以順式結(jié)合到多肽－GroEL

二元復(fù)合體上,封住了多肽,提供了一個(gè)保護(hù)的環(huán)境,使蛋白質(zhì)不可能聚集,同時(shí)GroES

的結(jié)合誘導(dǎo)GroEL

構(gòu)象發(fā)生了大的變化,使中央空腔體積加倍并且掩蓋了疏水多肽結(jié)合區(qū),刺激了多肽的折疊反應(yīng),當(dāng)折疊持續(xù)約15～30s后,ATP水解,釋放GroES。65②反復(fù)退火模型(interativeannealingmodel):在非變性情況下,未折疊的蛋白質(zhì)(Iuf)處于天然態(tài)或者誤折疊中間體(Imf)。分子伴侶(無論是GroEL

還是其它小分子伴侶)結(jié)合到這些誤折疊的蛋白質(zhì)上,促進(jìn)其解折疊,所以多肽又獲得了達(dá)到天然態(tài)的機(jī)會(huì)。66

在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移或蛋白質(zhì)插入E.coli

細(xì)胞質(zhì)膜過程中起重要作用Phillips等實(shí)驗(yàn)表明,在GroEL

功能缺陷的E.coli

菌株中,分泌蛋白的輸出受到損傷。根據(jù)熒光印跡結(jié)果分析，GroEL

的膜靶蛋白是SecA,SecA

是轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中的一個(gè)中心蛋白,SecA

和SecY形成蛋白質(zhì)傳導(dǎo)膜通道。GroEL

與膜結(jié)合的SecA

相互作用同某些生理活動(dòng)是相關(guān)的,如GroEL

能與新合成的分泌蛋白或膜蛋白相互作用,促進(jìn)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)其插入細(xì)胞質(zhì)膜中。GroEL

作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能是通過維持SecA

在各種條件下的功能活性構(gòu)象來實(shí)現(xiàn)的。67體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GroEL

幾乎和任何非天然的模式蛋白作用,然而在體內(nèi),GroEL

僅參與約1/10的新生肽的折疊過程。用免疫共沉淀及二維聚丙烯酰胺凝膠分離GroEL的作用底物,Walid

等得到52種GroEL

結(jié)合的蛋白質(zhì),包括轉(zhuǎn)錄-翻譯機(jī)制中的組成成分,像RNA聚合酶的亞基、延長因子Tu

和幾個(gè)氨酰tRNA

合成酶,結(jié)果表明,GroEL

的典型底物的相對(duì)分子質(zhì)量介于(20～60)×103

之間,其結(jié)構(gòu)傾向于包括幾個(gè)α、β結(jié)構(gòu)域(同E.coli

內(nèi)源蛋白比較),如S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括3個(gè)αβ結(jié)構(gòu)域,50S核糖體蛋白L9、烯醇化酶、甘油醛232磷酸脫氫酶A等均有2個(gè)αβ結(jié)構(gòu)域。因?yàn)棣?螺旋和β-折疊提供了同GroEL

頂端結(jié)構(gòu)域作用的理想的疏水面,GroEL能很快識(shí)別含有αβ結(jié)構(gòu)的多肽,幫助其正確折疊。所以,我們可以用分子伴侶在大腸桿菌中的共表達(dá)來提高新生肽的合成。682.熱休克蛋白70家族

Hsp70家族是進(jìn)化史上最保守的蛋白質(zhì)之一。它的家族成員包括四個(gè):grp78、mtp70、hsc70及hsp70。前三種是在正常條件下產(chǎn)生的,而hsp70是由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生。Hsp70同疏水的肽類有高親和力,并且隨著ATP的水解而增高。Hsp70與多肽之間的可逆作用在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、錯(cuò)誤折疊多肽的降解及其調(diào)控過程中有重要作用。Hsp70之所以能起如此重要的作用是由它的結(jié)構(gòu)決定的。69Hsp70的結(jié)構(gòu)Hsp70結(jié)構(gòu)由兩部分組成,一部分主要由一個(gè)N端高度保守的44kD的三磷酸腺苷酶(ATPase)功能域(ATPbindingdomain)；另一部分由一個(gè)分子質(zhì)量為25kD的C端區(qū)域組成。N端ATPase功能域的結(jié)構(gòu)類似于凝聚素和己糖激酶,主要由兩個(gè)大的球形亞功能域Ⅰ和Ⅱ組成,其間被一個(gè)深的中央裂縫分開,并通過2個(gè)交叉的α螺旋相連接；亞功能域和連接的α螺旋和裂縫的底部形成一個(gè)核苷酸及所需的Mg2+和K+

的結(jié)合袋,核苷酸經(jīng)過與兩個(gè)磷酸結(jié)合環(huán)和一個(gè)疏水腺苷的相互作用而定位在活性部位,并與HSP70側(cè)鏈結(jié)合的Mg2+

相聯(lián)系。70C端區(qū)域又分一個(gè)保守的15kD的多肽的結(jié)構(gòu)功能域和一個(gè)不保守的靠近C端的10kD可變區(qū)功能域,zhu等在1996年研究表明Dnak(HSC70)底物結(jié)合功能域和端分可變區(qū)域重組片段的結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成,第一部(N端)折疊或一個(gè)緊密的β三明治(β-sandwich)結(jié)構(gòu)。第二部分(C端)由5個(gè)A螺旋組成,形成一個(gè)松弛的α螺旋結(jié)構(gòu)。如圖1,松弛構(gòu)象的多肽結(jié)合在由β-三明治結(jié)構(gòu)形成的底物結(jié)合通道中,而α螺旋部分位于多肽結(jié)合單位之上,象一個(gè)蓋子覆蓋在結(jié)合通道上面,而不與底物直接接觸,所以能阻止結(jié)合底物的逃脫。71圖1

DnaKC端區(qū)域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖7273Hsp70的作用機(jī)理Hsp70的ATPase

活性很弱,活體內(nèi)它通?？赡芴幱贏TP結(jié)合狀態(tài)(α螺旋蓋子處于開的狀態(tài)),在此狀態(tài)下,它們不能穩(wěn)定地結(jié)合多肽。對(duì)如何進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)，Hartl研究表明Hsp70ATP的水解反應(yīng)周期包括5個(gè)步驟：74

1、分子伴侶DnaJ

首先暫時(shí)與未折疊多肽迅速結(jié)合。2、DnaK-ATP與DnaJ

的J功能域通過未確定的DnaK

的結(jié)合位點(diǎn)相互作用,然后把蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)移到打開的DnaK-ATP底物結(jié)合袋中。即DnaK-ATP從DnaJ-底物復(fù)合物中接受多肽。3.DnaJ

與DnaK

相互作用促進(jìn)ATP水解,并使未折疊多肽和DnaK

復(fù)合物穩(wěn)定地處于ADP結(jié)合狀態(tài);然后DnaJ從DnaK-ADP-底物-DnaJ

三元復(fù)合物解離下來。4、核苷酸交換因子GrpE與DnaK-ADP-底物復(fù)合物結(jié)合,引起ADP的釋放。5、ATP快速與DnaK

結(jié)合,α螺旋蓋子打開,引起底物和GrpE

的釋放,DnaK

恢復(fù)到起始狀態(tài)。解離的底物將進(jìn)一步折疊,或重新與DnaJ和DnaK

結(jié)合或轉(zhuǎn)移到其他的分子伴侶系統(tǒng)(如GroE),完成最后的折疊。75Hsp70的功能

Hsp70廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠素等細(xì)胞的各個(gè)部分,它作為分子伴侶參與所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的從頭合成和定位、蛋白質(zhì)的成熟和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解及調(diào)節(jié)過程,因而能夠嚴(yán)重地影響生長在正常條件和脅迫條件下生存的細(xì)胞功能和代謝過程。脅迫下Hsp70的功能Hsp70在脅迫下的保護(hù)功能知道很少。體外實(shí)驗(yàn)表明DnaK

能溶解某些熱變性蛋白的聚集物,但是活體內(nèi)分子伴侶在脅迫下的保護(hù)機(jī)理則主要是通過與脅迫誘導(dǎo)的未折疊底物多肽的結(jié)合而阻止其聚集變性。如轉(zhuǎn)化的E.coli

細(xì)胞放在42℃,其中表達(dá)的螢火蟲螢光素酶活性喪失,若在此熱脅迫期間細(xì)胞內(nèi)有DnaK、DnaJ

和GrpE

功能多肽存在時(shí),其酶活性在30℃時(shí)又可以得以恢復(fù),反之則不能恢復(fù),說明分子伴侶在脅迫下能夠具有保護(hù)酶結(jié)構(gòu)的作用。76在蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸中的作用Hsp70不僅能幫助線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新輸入蛋白質(zhì)的折疊,而且參與蛋白質(zhì)的移位過程,實(shí)驗(yàn)證明Hsp70用一種類似于棘輪的分子機(jī)制促進(jìn)蛋白質(zhì)移位。773.熱休克蛋白90家族熱休克蛋白90家族(Hsp90family),分子量在90kD左右。Hsp90可以與腦漿中的類固醇激素受體結(jié)合,封閉受體的DNA結(jié)合域,阻礙其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的激活作用,使之保持在天然的非活性狀態(tài)。但Hsp90的結(jié)合也使受體保持著對(duì)激素配體的高親和力。Hsp90還與Ras

信號(hào)途徑中許多信號(hào)分子的折疊與組裝密切相關(guān),主要是Hsp90的結(jié)合與解離介導(dǎo)了這些分子在非活性與活性之間的轉(zhuǎn)化。784.其它種類的分子伴侶包括T受體結(jié)合蛋白(TRAP)、大腸桿菌的SecB

和觸發(fā)因子(triggerfactor)及PapD、噬菌體編碼的支架蛋白(scaffoldingproteins)等。目前研究不多,其作用機(jī)理也不太明了。797.2.5分子伴侶的功能分子伴侶介導(dǎo)線粒體蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子伴侶調(diào)節(jié)信息傳遞通路分子伴侶參與微管形成與修復(fù)80分子伴侶介導(dǎo)線粒體蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)在細(xì)胞質(zhì)中合成的線粒體蛋白質(zhì)必須穿越線粒體膜到達(dá)其行使功能的部位。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(translocation)過程是單向進(jìn)行的。完成這一單向轉(zhuǎn)運(yùn)過程需要分子伴侶,它們能解開細(xì)胞質(zhì)內(nèi)前體蛋白(precursor)折疊的結(jié)構(gòu)域,牽拉多肽鏈穿膜而過,最后再幫助已進(jìn)入基質(zhì)的肽鏈重新折疊。前體蛋白在線粒體外去折疊研究表明胞質(zhì)中的前體蛋白通常不緊密折疊,并因此對(duì)蛋白酶的消化極為敏感。某些蛋白質(zhì)雖緊密折疊,但緊密折疊的結(jié)構(gòu)域至少在某些情況下會(huì)影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，

因此在轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)前體蛋白必須在線粒體外膜外面打開,或者保持松弛狀態(tài)且防止松弛狀態(tài)的蛋白質(zhì)聚集(aggregation)。81胞質(zhì)Hsp70s家族成員(ct-Hsp70)可與前體蛋白相互作用,防止前體蛋白形成不可解開的構(gòu)象,也可以防止已松弛的前體蛋白聚集。在體外情況下去除ct-Hsp70將導(dǎo)致線粒體ATPaseβ亞基前體在胞質(zhì)中聚積。另有人發(fā)現(xiàn)除ct-Hsp70s外,還有一種細(xì)菌DnaJ

的同源分子YDJ1在高溫應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮同樣的作用。前體蛋白與一種叫線粒體輸入刺激因子(mitochondrialimportstimulatingfactor,MSF)的胞質(zhì)分子伴侶形成復(fù)合物后,再與線粒體膜上的輸入受體(importreceptor)結(jié)合,并最終進(jìn)入線粒體外膜的輸入通道。82多肽鏈穿越線粒體膜線粒體基質(zhì)Hsp70(mHsp70)可與進(jìn)入線粒體腔的前導(dǎo)肽鏈(precursorchain)交聯(lián),提示mHsp70直接參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Simon等提出一種作用機(jī)制—布朗棘輪模型(Brownianrachetmodel)，該模型認(rèn)為在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)孔道內(nèi),多肽鏈做布朗運(yùn)動(dòng)搖擺不定,一旦前導(dǎo)肽鏈自發(fā)進(jìn)入線粒體腔,立即有一分子mHsp70結(jié)合上去,這樣就防止了前導(dǎo)肽鏈退回細(xì)胞質(zhì)。隨著肽鏈進(jìn)一步伸入線粒體腔,肽鏈會(huì)結(jié)合更多的mHsp70分子。根據(jù)該模型可以預(yù)測(cè)一條折疊肽鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)不快于它的自發(fā)解鏈。83許多蛋白質(zhì)的自發(fā)解鏈極慢,如細(xì)胞色素b2,其速度常以小時(shí)計(jì),但細(xì)胞色素b2可在幾分鐘內(nèi)進(jìn)入線粒體。對(duì)這種快速轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)生最直接的解釋是mHsp70可拖拽前導(dǎo)肽鏈。要拖拽肽鏈,mHsp70必須同時(shí)附著在肽鏈和線粒體膜上。這樣的排列方式使mHsp70通過改變構(gòu)象即可產(chǎn)生拖力。首先mHsp70以一種高能構(gòu)象結(jié)合前導(dǎo)肽鏈,然后松弛為一種低能構(gòu)象,促使前導(dǎo)肽鏈進(jìn)入,并迫使后面的肽鏈解鏈以進(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)孔道。這種假說將mHsp70描繪為轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)動(dòng)機(jī),類似于肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)的牽拉作用。84多肽鏈在線粒體基質(zhì)內(nèi)重新折疊蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)后必須折疊為天然構(gòu)象以行使功能。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明基質(zhì)內(nèi)Hsp60參與該過程。mHsp60介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊依賴ATP且需要另一種分子伴侶Hsp10的輔助。Rowley等發(fā)現(xiàn)MDJ1(線粒體DnaJ,在酵母中稱為MDJ1)在正常溫度下對(duì)蛋白質(zhì)折疊不是必要的,但在高溫應(yīng)激時(shí)則不可或缺。8586分子伴侶調(diào)節(jié)信息傳遞通路分子伴侶能調(diào)節(jié)許多激酶、受體和轉(zhuǎn)錄因子的活性。分子伴侶參與微管形成與修復(fù)近幾年研究證實(shí)包括TCP-1在內(nèi)的伴侶素可輔助新合成的肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的折疊.TCP-1作為分子伴侶輔助微管蛋白的正確折疊與裝配。87分子伴侶研究的實(shí)際應(yīng)用生物學(xué)最基礎(chǔ)的重大理論問題在基因工程和蛋白工程中，表達(dá)產(chǎn)物在寄主細(xì)胞內(nèi)自發(fā)地正確折疊而發(fā)生沉淀形成包涵體，因而仍然不能以高產(chǎn)率獲得活性蛋白，構(gòu)建分子伴侶在細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)或融合表達(dá)以幫助目的蛋白的正確折疊?，F(xiàn)在已經(jīng)有商品質(zhì)粒供應(yīng)，在體外用變性劑溶解包涵體蛋白，然后用分子伴侶幫助提高復(fù)活效率都已經(jīng)有了許多肯定的結(jié)果。由于分子伴侶在生命活動(dòng)的各個(gè)層次都具有重要作用，它本身的突變和損傷也必定會(huì)引起疾病?？梢赃\(yùn)用分子伴侶的知識(shí)來治療“分子伴侶病”。887.3幫助蛋白質(zhì)折疊的酶蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase,PDI)，它催化蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的形成。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl

cis/transisomerase,PPI),它催化蛋白質(zhì)分子中某些穩(wěn)定的反式肽基脯氨酰鍵,異構(gòu)成功能蛋白所必需的順式構(gòu)型。二硫鍵的形成和脯氨酰鍵的順反異構(gòu)都是共價(jià)反應(yīng),通常是蛋白質(zhì)折疊過程中的限速步驟。89PDI存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi),含量豐富,占到細(xì)胞總蛋白的0.4%。它是一個(gè)非常特殊的多功能蛋白,而且具有顯著的非特異的多肽結(jié)合能力,這正是一個(gè)蛋白質(zhì)分子可能成為分子伴侶所必備的重要條件.考慮到PDI