第七章發(fā)酵工藝控制

第七章發(fā)酵工藝控制本章主要內容：1、工業(yè)發(fā)酵的主要類型2、工業(yè)發(fā)酵的主要控制參數(shù)3、染菌對發(fā)酵的影響及防治4、發(fā)酵工藝的放大5、發(fā)酵過程的自動控制本章重點掌握：菌體濃度、基質、溶氧、PH值、溫度、泡沫、CO2等參數(shù)對發(fā)酵的影響。本章主要內容第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵的主要類型一、按投料方式分1、分批發(fā)酵(batchfermentation)

2、補料分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)3、連續(xù)發(fā)酵(continuousfermentation)。1、分批發(fā)酵概念：

分批發(fā)酵：指將微生物和營養(yǎng)物一次性加入發(fā)酵罐中，經過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式，中間除了空氣進入和尾氣排出，沒有物料交換。在分批發(fā)酵中，培養(yǎng)基是一次性加入，不再補充，隨著微生物的生長繁殖活躍，營養(yǎng)物質逐漸消耗，有害代謝產物不斷積累，因此其生長速度將隨時間發(fā)生有規(guī)律性的變化。遲滯期對數(shù)期恒定期衰亡期時間細菌數(shù)目的對數(shù)分批發(fā)酵微生物的生長曲線

微生物的生長曲線延滯期主要特征：代謝活躍，大量合成細胞分裂所需的酶類、ATP等；體積增大；分裂遲緩。原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關底物的酶。縮短延滯期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質和條件一致、保證培養(yǎng)基適宜的營養(yǎng)濃度?？s短延滯期目的：縮短發(fā)酵周期、增加產量和避免染菌。指數(shù)生長期指數(shù)期微生物的生理特征：養(yǎng)分空間充足，排出的代謝廢物濃度還不影響生長，此期分裂速度最快、代謝活動旺盛、對環(huán)境變化敏感。作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產中用作種子的最佳時期。穩(wěn)定期特點：新生的細胞和死亡的細胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達到最大值、代謝活力鈍化。原因：營養(yǎng)物質的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。功能：產生次生代謝產物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)發(fā)酵技術。衰亡期

細胞死亡率增加，明顯超過新生率，進入衰亡期。多數(shù)發(fā)酵在到達衰亡期前就結束。

特點：活的細胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細胞裂解或自溶。衰亡期比其它期相對較長。分批發(fā)酵優(yōu)缺點：優(yōu)點：操作簡單周期短染菌機會少產品質量易于控制缺點：生產能力不是很高非生產周期較長，使得發(fā)酵成本高二、連續(xù)發(fā)酵

1.概念：

微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時以相同速度不斷放出代謝物，使微生物細胞在近似恒定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方式。實驗室連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖

(a)恒化培養(yǎng)系統(tǒng)(b)恒濁培養(yǎng)系統(tǒng)1容器2控制閥3培養(yǎng)室4排出管5光源6光電池7流出液

2.特點：

菌的濃度，產物濃度，限制性基質濃度均處于恒定狀態(tài)。3.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點:可以維持穩(wěn)定的操作條件，有利于微生物的生長代謝，從而使產率和產品質量也相應保持穩(wěn)定。能夠更有效的實現(xiàn)自動化，降低勞動強度，減少工人與病原微生物和毒性產物接觸的機會。減少設備清洗、準備和滅菌等非生產占用時間，提高設備利用率，節(jié)省勞動力和工時。由于滅菌次數(shù)減少，使測量儀器探頭的壽命延長。容易對過程進行優(yōu)化，有效提高發(fā)酵產率。缺點:長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產量，發(fā)酵周期長染菌機會增加。對設備、儀器及控制器件的技術要求較高。粘性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長和在發(fā)酵液中結團，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來困難。應用：常用于研究工作中，廢水處理、面包酵母、啤酒發(fā)酵等工業(yè)中。三、補料分批培養(yǎng)概念：補料分批發(fā)酵(fed-batchculture，簡稱FBC)，又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加一種或多種成分的新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。補料分批培養(yǎng)是分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種過渡培養(yǎng)方式，是一種控制發(fā)酵的好方法，現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。

補料分批培養(yǎng)分兩種類型：①單一補料分批發(fā)酵：指在開始時投入一定數(shù)量的基礎培養(yǎng)基，到發(fā)酵過程的適當時期，開始連續(xù)補加一種或多種成分的新鮮培養(yǎng)基，直到發(fā)酵液體積達到發(fā)酵罐最大操作容積后停止補料，最后將發(fā)酵液一次性全部放出。②反復補料分批培養(yǎng)：單一補料的基礎上，每隔一定時間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積始終不超過發(fā)酵罐的最大容積。2.補料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：與分批培養(yǎng)相比①解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效應。②可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的一切影響；③可用作為控制細胞質量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；④可作為理論研究的手段，為自動控制和最優(yōu)控制提供實驗基礎。

與連續(xù)培養(yǎng)相比優(yōu)點①降低了染菌，避免了遺傳不穩(wěn)定性。②產生菌也不會產生老化和變異等問題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣泛。

二、按菌體生長與產物形成關系分1、生長關聯(lián)型特點：菌體生長、基質消耗和產物合成大體上呈正比關系（菌體生長、碳源利用和產物形成幾乎都在相同的時間出現(xiàn)高峰，即表現(xiàn)出產物形成直接與碳源利用有關）。如：單細胞蛋白、葡糖酸和酒精發(fā)酵2、生長部分關聯(lián)型產物形成和菌體的生長是部分分開的。菌體生長和產物合成是分開的，糖分既供應生長的能量，又充作產物合成的碳源。發(fā)酵過程中有兩個時期對糖的利用最為迅速，一個是最高生長時期，另一個是最大產物合成時期。如：檸檬酸和部分氨基酸發(fā)酵3、生長無關聯(lián)型發(fā)酵過程分兩個階段特征是產物合成與碳源利用無準量關系；通常產物合成在菌體生長停止及底物耗完后才開始。如：許多抗生素和色素的發(fā)酵

第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)一、物理參數(shù)1、溫度與溫度有關的因素：氧在培養(yǎng)液中的溶解度和傳遞速率菌體生長速率和產物合成速率測量工具：鉑電阻或熱敏電阻2、壓力（Pa）與壓力高低有關的因素：罐壓高低與氧和CO2在培養(yǎng)液中的溶解度有關罐壓一般范圍：0.2×105～0.5×105Pa測量工具：

隔膜法壓力表或壓敏電阻壓力表3、攪拌轉速（r/min）

影響攪拌轉速的因素：氧和CO2在培養(yǎng)液中的溶解度發(fā)酵液的均勻性測量工具：

頻率計數(shù)器或轉速表

4、攪拌功率（KW）

指每立方米發(fā)酵液所消耗的功率。

5、空氣流量（vvm）

指每分鐘內向每單位體積發(fā)酵液通入的空氣體積。空氣流量一般控制在0.5-1.0vvm6、黏度（Pa.s）

測黏度的意義：細胞生長活細胞形態(tài)的一項標志；發(fā)酵罐中菌絲分裂過程情況。測量工具常用渦輪旋轉式粘度計7、料液流量（L/min）

控制流體進料的參數(shù)。二、化學參數(shù)1、pH2、基質濃度（g/L或%）3、溶氧濃度（mmol/L,mg/L）4、氧化還原電位（mv）5、產物的濃度（μg/ml）6、廢氣中的氧濃度（Pa）7、廢氣中的CO2濃度（%）

三、生物參數(shù)1、菌體形態(tài)菌體形態(tài)是衡量種子質量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。用顯微鏡觀察菌體形態(tài)2、菌體濃度

概念：菌體濃度是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。根據(jù)菌體濃度的大小決定適合的補料量和供氧量，同時可判斷目的產物的產量是否達到最大量。一、菌體濃度對發(fā)酵的影響（1）菌體濃度大小直接影響產物產率

一般說，菌體濃度越大，產物產率越大。但是菌體濃度過大反而有副作用：濃度過大，營養(yǎng)物質消耗過快，可能引起發(fā)酵液性質明顯改變和有毒代謝產物的積累，從而改變了代謝途徑。對于微生物的產物生成與生長呈部分關聯(lián)型，如果菌體濃度過大，營養(yǎng)基質大部分用來滿足菌體的生長，到產物生產期營養(yǎng)不足導致產率降低。（2）濃度對發(fā)酵液溶解氧的影響

菌體濃度增加，攝氧率增加，但表觀黏度也隨之增加，氧的傳遞速率降低，當攝氧速率大于供氧速率時，溶氧濃度由于不足就會成為限制因素。

為了獲得最高的生產率，需要采用攝氧速率OUR與傳氧速率OTR相平衡時的菌體濃度，也就是傳氧速率隨菌濃變化的曲線和攝氧速率隨菌濃變化的曲線的交點所對應的菌體濃度，即臨界菌體濃度c(X)臨。二、菌體濃度的控制

控制菌體濃度的措施：

通過改變基質濃度及中間補料控制菌體濃度。三、發(fā)酵過程菌體濃度的檢測

常用的方法有：濁度法、干重法、離心稱重法或測體積法。

濁度法：使用的儀器為分光光度計

方法：取發(fā)酵液在420-600nm波長范圍內測定光密度（OD）值。吸光度要求控制在0.3-0.5范圍內，這個范圍內發(fā)酵液濃度與吸光值正相關，不在此范圍內的要稀釋發(fā)酵液。第四節(jié)基質濃度對發(fā)酵的

影響及控制一、基質濃度對發(fā)酵的影響1、基質濃度對菌體生長的影響菌體比生長率與基質濃度曲線圖為拋物線形如下圖。

2、基質濃度對產物形成和發(fā)酵液特性的影響基質濃度過濃可能會導致以下現(xiàn)象：①可能會改變產物的代謝方向或產生產物合成的阻遏現(xiàn)象；②菌體生長過旺，發(fā)酵液過于粘稠，菌體細胞消耗能量維持生存環(huán)境，用于非生產能量增加。③基質濃度過大，使發(fā)酵液黏度過大，從而影響溶解氧的傳遞，進而影響菌體的生長和產物的合成。二、基質濃度的控制

用中間補料的方法控制基質濃度。有效性進行中間補料，要做到選擇恰當?shù)难a料內容、補料方式和反饋控制參數(shù)。補料內容：指補加的培養(yǎng)基成分。選擇限制性的一種或幾種成分加以補充。補料方式：指補料時機和補料順序。

補料方式分為：分批補加和連續(xù)流加，連續(xù)流加又分為等速補料和變速補料等方式。反饋控制參數(shù)：指導補料方式的控制參數(shù)。直接反饋控制參數(shù):控制碳源、氮源或碳氮比。間接反饋控制參數(shù)：溶氧、pH、呼吸熵、排氣中二氧化碳分壓及代謝物濃度。

第五節(jié)溶解氧濃度對發(fā)酵的影響及控制一、溶氧濃度對發(fā)酵的影響影響耗氧的因素有以下幾方面：

⑴培養(yǎng)基的成分和菌體濃度顯著影響耗氧⑵菌齡影響耗氧⑶發(fā)酵條件影響耗氧1、溶氧濃度對微生物生長的影響微生物的吸氧量常用呼吸強度和耗氧速率兩種方法來表示。呼吸強度又稱氧比消耗速率，是指單位質量的干菌體在單位時間內所消耗的氧量，以QO2表示，單位為mmolO2／(g干菌體·h)。耗氧速率又稱攝氧率，是指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內的吸氧量，以r表示，單位為mmolO2／(L·h)。

式中r——微生物的耗氧速率，mmolO2／(L·h)；

——菌體的呼吸強度，mmolO2／(g干菌體·h)；X——發(fā)酵液中菌體的濃度，g干菌體／L。生長臨界氧濃度：

P95各種微生物生長對發(fā)酵液中溶解氧濃度有一個最低要求，這一溶解氧濃度稱為生長臨界氧濃度。培養(yǎng)過程中不需要使溶解氧濃度達到飽和值。一般微生物生長臨界氧濃度是飽和濃度的1%-30%。溶氧濃度高于臨界溶氧濃度時,對微生物的生長有利（）。判斷臨界氧濃度溶氧濃度2、溶氧濃度對產物合成的影響產物合成臨界氧濃度：微生物產物的合成也有一臨界溶氧濃度，稱為產物合成臨界氧濃度。

產物的合成也有一合適的溶解氧濃度，溶解氧濃度太高反而會抑制產物的合成。最佳合成溶氧濃度可能低于最適生長溶氧濃度或生長臨界氧濃度，也可能高于最適生長溶氧濃度或生長臨界氧濃度。第一類：有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸等谷氨酸系氨基酸，它們在溶氧濃度高于或等于生長臨界濃度的條件下，產量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就會受到強烈的抑制，大量積累乳酸和琥珀酸；第二類：包括異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高產量，但供氧受限，產量受影響并不明顯；第三類：有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，僅在供氧受限、細胞呼吸受抑制時，才能獲得最大量的氨基酸，如果供氧充足，產物形成反而受到抑制。

亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸三種氨基酸最佳合成氧濃度分別為生長臨界濃度的0.55倍、0.6倍和0.85倍。判斷：在生產中，要保證最高產物產量，供氧時必須使溶氧濃度大于生長臨界溶氧濃度（）。需氧發(fā)酵產物合成是不是溶氧愈高愈好,為什么?舉例說明。問題二、發(fā)酵液溶解氧濃度控制（一）從供氧方面控制氧的傳遞速率總方程式：

N=KLα（C*-CL）式中：N---單位體積培養(yǎng)液中的傳氧速率，[mol/m3·s]；

KL---以濃度差為推動力的總傳質系數(shù)（m/s)α–比表面積（m2/m3)KLα---以濃度差為推動力的體積傳遞系數(shù)，（s-1）；CL---發(fā)酵液主流中氧的實際濃度，（mol/m3）；

C*---罐中氧分壓下溶液中氧的飽和濃度（mol/m3）；

α很難測定，

KLα可作為一項，稱之為液相體積傳氧系數(shù)。

根據(jù)供氧速率公式，凡影響（c*-CL）和KLα的因素都會影響氧的傳遞速率。

1、影響（c*-cL）的因素及控制

要想增加氧傳遞的推動力（C*－CL），就必須設法提高C*（氧分壓下溶液中氧的飽和濃度），或降低CL（發(fā)酵液主流中氧的實際濃度）。

（1）提高飽和溶氧濃度C*影響因素C*有：①溫度：發(fā)酵溫度依據(jù)微生物生理特性而定，不能任意變動.②溶液的組成：隨濃度降低氧飽和度提高。可通過開始用較稀培養(yǎng)液濃度，然后中間補料的方式，同時在發(fā)酵中后期，可通入無菌水降低基質黏度來提高溶氧度，但有局限性。③罐壓：罐壓增加，溶解氧濃度增加，但CO2也增加且更快。不利于液相中CO2排出。對細胞滲透壓有不利影響。④富氧通氣：富氧通氣、溶解氧增加。但生產成本提高，不夠經濟。（2）降低發(fā)酵液中氧的實際濃度CL

降低發(fā)酵液中的CL，可采取減少通氣量或降低攪拌轉速等方式來實現(xiàn)。但是，發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的CL不能低于C臨界，否則就會影響微生物的呼吸。目前發(fā)酵所采用的設備，其供氧能力已成為限制許多產物合成的主要因素之一，故此種方法亦不可取。2、影響KLα的因素及控制措施比表面積α：氣泡表面積與體積之比，比表面積越大，氧傳遞速率越大。所以影響氧傳質系數(shù)KLα的主要因素有：攪拌效率空氣流速發(fā)酵液的理化性質、泡沫狀態(tài)空氣分部器形狀和發(fā)酵罐的結構等影響KLα的因素（1）攪拌：

①攪拌使汽泡變小，增大汽液相接觸面積，延長汽泡在液體中的停留時間；增加湍動程度，減小氣泡外液膜厚度，減小阻力，使KLα值增大；攪拌避免結團，使培養(yǎng)基成分和細胞均勻分布，利于營養(yǎng)物吸收，代謝物擴散。攪拌比通氣速度對KLα的影響更明顯。但攪拌速度過高，會對細胞造成損傷，并會增加傳熱的負擔；通氣效率還與罐體積（越小越好）、罐形狀、結構、攪拌器形式、擋板有關。影響KLα的因素（2）空氣流量：供氧，帶走廢氣。KLα隨空氣流量增加而增加，但有限度。如超過限度，攪拌器在空氣泡中空轉，不能分散空氣，攪拌功率下降。氣沿軸逸出。因此，發(fā)酵過程中，應控制空氣流量，使攪拌軸附近沒有大的氣泡溢出。影響KLα的因素（3）發(fā)酵液的理化性質

理化性質對KLα的影響主要有黏度、泡沫等因素。黏度KLα↓氧的溶解速率↓

泡沫：發(fā)酵過程中形成的泡沫易于菌體形成穩(wěn)定的乳濁液，阻礙氧的傳遞。

消沫措施：消沫使KL下降（雖使α

增大）①加入消沫劑（過多積累對菌體有害）

②安裝消沫器影響KLα的因素（4）空氣分部器和發(fā)酵罐的結構空氣分部器有多孔環(huán)狀和單孔兩種。如多孔環(huán)狀分部器直徑大于攪拌器直徑，空氣會沿罐壁溢出，供氧效果差?？諝饬髁窟_到一定程度后，單孔分部器有優(yōu)勢，可增強發(fā)酵液的湍動程度。（二）從耗氧方面考慮對發(fā)酵液溶解氧濃度控制

微生物耗氧與微生物的比生長率呈正相關，控制微生物營養(yǎng)物質濃度，從而控制其對氧的需求量。第四節(jié)中的內容三、發(fā)酵過程中溶解氧的檢測（一）發(fā)酵過程中溶解氧檢測的意義1、檢測溶液氧可度量發(fā)酵中氧是否足夠，了解微生物耗氧規(guī)律如：頭孢霉素生產中，發(fā)酵初期溶解氧濃度控制在飽和溶解濃度左右，而后期溶解氧濃度則控制在飽和濃度的10%-29%。

2、溶解氧濃度作為發(fā)酵異常情況的指示溶氧異常下降：P98原因：①污染好氣性雜菌

②菌體代謝發(fā)生異常現(xiàn)象，需氧量增加

③某些設備或控制工藝發(fā)生故障。溶氧異常上升：原因：①菌體代謝發(fā)生異常，需氧下降

②污染噬菌體，菌體呼吸受抑制

在發(fā)酵過程中引起溶氧異常升高或下降可能有哪些原因

?（二）溶解氧（DO）檢測方法

采用復膜氧電極測定法

復膜氧電極有兩種類型：

1、原電池型：銀陰極和鉛陽極置于堿性電解質中.

2、極譜型：管狀銀陽極、鉑絲陰極、氯化鈉電解液和極化電源組成.

第六節(jié)

pH值對發(fā)酵的影響及控制發(fā)酵液pH對菌體生長、繁殖和產物積累影響較大。生產前應進行試驗和研究。菌體生長、繁殖和產物積累的最適pH不一定相同。微生物生長最適pH值范圍

不同的微生物具有不同的最適生長的pH值。細菌6.5-7.5；放線菌6.5-8.0；霉菌4.0-5.8；酵母菌3.8-6.01、pH對發(fā)酵的影響pH對微生物生長和產物形成影響主要體現(xiàn)以下方面：pH影響基質和中間代謝產物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用。pH影響酶的活性，以致影響菌體的生長和產物的合成；甚至代謝途徑會改變。pH影響菌體細胞結構的變化和細胞形態(tài)的變化，從而影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收和代謝產物的形成。pH還對發(fā)酵液或代謝產物產生物理化學的影響，特別是對產物穩(wěn)定性的影響。如噻納霉素、青霉素二、發(fā)酵過程中pH的變化培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的代謝和代謝產物的產生引起pH的變化：培養(yǎng)基pH在發(fā)酵過程中能被菌體代謝所改變。若陰離子氮源被利用后產生NH3

，則pH上升；有機酸的積累，使pH下降。一般來說，高碳源培養(yǎng)基傾向于向酸性pH轉移，高氮源培養(yǎng)基傾向于向堿性pH轉移，這都跟碳氮比直接有關。生理酸性物質和生理堿性物質的消耗。引起發(fā)酵液中pH下降和上升的因素：P100三、發(fā)酵過程pH的確定和控制1、pH的確定因發(fā)酵過程中菌體本身具有調節(jié)pH的能力，另外菌種不同和代謝產物不同pH不同，所以pH的確定要以試驗的結果來確定。2、pH的控制選擇pH值的方