《發(fā)酵工程》第2章 菌種與種子擴大培養(yǎng)

第二章菌種與種子擴大培養(yǎng)

掌握微生物工業(yè)對菌種的要求、了解其常用微生物工業(yè)生產用菌種的來源掌握生產菌種的保藏、選育方法及防止菌種衰退的措施了解種子擴大的任務

掌握工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型

了解影響種子質量的主要因素

Contents(4學時)發(fā)酵工業(yè)用菌種

種子擴大培養(yǎng)

重點：菌種的選育、保藏方法，防止菌種衰退的措施以及影響種子質量的因素。種子擴大培養(yǎng)定義

難點：影響種子質量的因素。第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)用菌種

發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求工業(yè)上常用的微生物及來源生產用菌種的保藏及選育防止菌種衰退的措施一、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求

發(fā)酵工業(yè)用的菌種盡管多種多樣，但作為大規(guī)模生產，對菌種選擇要求如下：能在價格低廉的培養(yǎng)基上快速生長，大量合成目的產物

可以在要求不高，易于控制的培養(yǎng)條件下（糖濃度、溫度、PH、溶解氧、滲透壓等）迅速生長和發(fā)酵，以縮短發(fā)酵周期。天氣炎熱地區(qū)選擇耐高溫的菌種更為適宜根據代謝調控的要求，選擇高產菌株，如營養(yǎng)缺陷型突變菌株或調節(jié)突變菌株或野生菌株選擇抗噬菌體能力強的菌株，使其不易感染噬菌體菌種純，不易變異退化，以保證發(fā)酵生產和產品質量的穩(wěn)定性不能是病原菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保證安全

二、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產、國防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代謝產物多，已超過1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)生產的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過40－50種。微生物具有巨大的潛力可挖掘。工業(yè)上常用菌種舉例：常用的工業(yè)微生物菌種如下：細菌放線菌酵母菌霉菌

1、常用的細菌大腸桿菌應用：對谷氨酸定量分析，生產天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

乳酸桿菌應用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作

枯草芽孢桿菌應用：生產淀粉酶2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母應用：生產酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質、生產脂肪啤酒酵母紅酵母面包酵母3、霉菌曲霉屬應用：生產有機酸、生產淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶應用：醬油、醬類（淀粉酶）米曲霉應用：產糖化酶和蛋白酶、主要用于釀酒制曲和醬油制曲應用：生產甲叉丁二酸(又名衣康酸)

毛霉應用：可以產生蛋白酶，我國多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應用：釀酒黑根霉是真菌的一種,常利用它的糖化作用,比如甜酒曲中的主要菌種就是黑根霉!黑根霉的最適生長溫度約為28℃，超過32℃不再生長青霉菌應用：生產青霉素、葡萄糖氧化酶4、放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素工業(yè)用菌種的來源購買如從菌種保藏機構或者其它研究機構購買：CGMCC(中國普通微生物菌種保藏管理中心),隸屬中科院CMCC中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心贈送篩選復壯三、生產用菌種的保藏及選育（一）菌種保藏

1、目的：提高菌種存活率，減少菌種的變異，保持原來優(yōu)良的生產性能。

2、原理：根據菌種的生物生理、生化特點，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。

保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質等，以達到降低其代謝活動，延長保存期的目的。

（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定時間進行移植培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏，如此反復。優(yōu)點：方法簡單、存活率高，具有一定的保藏效果。缺點：菌種仍有一定的強度的代謝活動條件，保存時間不長，傳代多，菌種容易變異。適用菌種：細菌、酵母、防線菌、霉菌

3、菌種保藏的方法：斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍干燥法、冷凍法、液態(tài)真空干燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。（2）礦物油保藏法將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。適用菌種：適用于除細菌外的其它菌種（3）砂土管保藏法利用土壤顆粒對微生物起保護作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。適用菌種：產孢子的微生物，對于一些對干燥敏感的細菌（奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌）以及酵母不適用。（4）真空冷凍干燥法先在菌懸液加入保護劑（如：脫脂牛奶、血清等）然后在較低溫度下使成凍結狀態(tài)，最后減壓抽干。

特點：它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達一年至數十年之久，并且存活率高，變異率低。單使手續(xù)麻煩，需要一定的設備。

適用菌種：對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。（5）其他保藏方法冷凍法：分低溫冷凍（－20℃）與超低溫冷凍（－196℃）兩種。適用于細菌、真菌、病毒等的保藏蒸餾水保藏法：菌體在無營養(yǎng)條件條件下4~10℃較長時間保藏。適用于酵母菌、真菌等。瓊脂穿刺封口保藏法：適用于不產孢子細菌的保藏曲法保藏：將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的干燥器中，干燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。麥粒保藏法：麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時，置通風、避光、干燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。無水硅膠保藏法：將細胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，加入裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于干燥器內，室溫或4℃保藏。對于細菌和真菌效果都較好。不同菌種采用不同保藏方法，以便長期保藏:1、酵母菌一般采用定期移植斜面低溫保藏法，將酵母接種子米曲汁或麥芽汁瓊脂斜面上，放于低溫處，每隔幾個月移植一次。酒精酵母經過數十年的移植沒有發(fā)現(xiàn)變異或衰退現(xiàn)象。也可采用石蠟油封藏法

2、曲霉過去采用定期移植斜面低溫保藏法，但極易發(fā)生變異現(xiàn)象。產生檸檬酸的黑曲霉連續(xù)移植多次甚至不生成分生孢子或不產檸檬酸。而改用砂土保藏法后，變異現(xiàn)象不再發(fā)生3、絲狀真菌特別是不產生孢子的擔子菌，可采用液氮超低溫凍結法保藏，但需專門的液氮冰箱4、一般細菌以冷凍干燥法保藏。乳酸菌可用麥殼保藏；丙酮丁醇梭菌，可用砂土管保藏。放線菌可用砂土管或冷凍保藏法保藏國內外菌種保藏機構菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機構，其中國際知識產權組織承認的法定的保藏機構僅有28家。1、我國的微生物菌種保藏機構2、國外主要的微生物菌種保藏機構

1）美國標準菌種收藏所（ATCC）2）美國冷泉港研究所（CSH）3）日本東京大學應用微生物研究所（IAM）4）日本東京科研化學有限公司（KCC）5）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）6）英國國立標準菌種收藏所（NCTC）7）美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）8）美國農業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（NRRL）（二）菌種選育

菌種選育

是按照生產的要求，根據微生物的遺傳和變異的理論，用人工方法使菌種變異，再經過篩選而達到菌種選育的目的。育種的目的:

改變菌種的特性，使產量提高、改進質量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等。微生物育種的基本方法包括以下幾種類型:自然選育抗噬菌體菌株的選育誘變育種代謝調控育種基因定向育種

自然選育是指在生產過程中不經過人工處理，利用菌種的自然突變而進行的菌種篩選的過程。

誘變育種是采用物理、化學誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯誤的DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結構變異，從而使細胞的功能發(fā)生改變。

微生物誘變育種的工作程序如下:

純化

細胞或孢子懸液制備

中間培養(yǎng)突變株分離

初篩

復篩生產性試驗

誘變劑處理離心收集菌體

離心洗滌玻璃珠振蕩分散

過濾

原菌株（出發(fā)菌株）代謝控制育種主要有兩個方面：一方面是改變代謝通路的育種，另一方面是改變代謝自動調節(jié)系統(tǒng)的育種。基因重組是雜交育種的基礎，其方法多種多樣，包括:有性雜交準性雜交轉化和轉導原生質體融合技術基因工程技術

四、防止菌種退化的措施

1、菌種退化：菌種的發(fā)酵能力降低、繁殖能力降低、發(fā)酵產品的得率降低區(qū)別于雜菌污染：

雜菌污染引起產量下降和影響菌種生長，容易和菌種退化相混淆，需通過劃線分離來確定是污染還是衰退。2、菌種退化的原因：一、菌種保藏不妥；二、菌種生長的要求沒有得到滿足；

經誘變得來的突變株由于發(fā)生回復突變，也會喪失新的特性。3、防止菌種退化的方法：

做好菌種保藏以保持菌種的優(yōu)良特性滿足菌種生長要求，減少傳代次數對已衰退的菌株進行分離、復壯4、菌種復壯方法①純種分離法；②淘汰已衰退的個體③采用其它方法：誘變因素處理，再進行單菌落分離；選擇合適的培養(yǎng)基

第二節(jié)種子擴大培養(yǎng)

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在沙土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌種經轉接到試管斜面活化后，再經扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得一定數量和質量的純種的過程。這些純培養(yǎng)物則稱為種子。種子擴大培養(yǎng)的任務工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型一、種子擴大培養(yǎng)的任務

◆任務：不僅要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的接種數量足夠的培養(yǎng)物。以便在發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)過程中盡可能地縮短遲滯期。◆根據菌種生長速度快慢來決定擴大培養(yǎng)的級數；※細菌（谷氨酸及其它氨基酸生產）生長較快，用二級放大培養(yǎng)（斜面菌種→一級種子搖床培養(yǎng)→二級種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐）※放線菌（生產抗生素）生長繁殖速度較慢，常常用三級種子擴大培養(yǎng)（其中鏈霉素須四級擴大）：即斜面菌種→一級種子搖床培養(yǎng)→二級（?。┓N子罐培養(yǎng)→三級（較大）種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐，一般50噸發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵。有些酶制劑發(fā)酵生產也采用三級發(fā)酵。二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型

工業(yè)微生物的培養(yǎng)方法兩大類型（1）靜置培養(yǎng)法（厭氣性發(fā)酵）例如：酒精、丙酮、丁醇、乳酸等發(fā)酵均屬于此類型。

（2）通氣培養(yǎng)法（好氣性發(fā)酵）。例如；氨基酸、核苷酸、有機酸和酶制劑等發(fā)酵均屬此類型。用作種子擴大培養(yǎng)的方法又可分為：液體培養(yǎng)法：三角瓶搖床振蕩或回轉式培養(yǎng)。

表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)，菌體生長在培養(yǎng)基表面。

固態(tài)培養(yǎng)法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等固體培養(yǎng)基（如麩皮）培養(yǎng)。大規(guī)模工業(yè)生產的培養(yǎng)方法及特點：園盤制曲機（園盤固體發(fā)酵機）A、固體培養(yǎng)（曲法培養(yǎng)）淺盤固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)B、液體培養(yǎng)淺盤液體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)：

目前幾乎所有的好氣發(fā)酵均采用液體深層發(fā)酵法；C、載體培養(yǎng)：用天然（或人工）多孔材料（如脲脘泡沫塑料）代替麥麩之類固態(tài)基質作微生物生長的載體，營養(yǎng)成分可嚴格控制。D、兩步法液體深層培養(yǎng)：在酶制劑和氨基酸生產中應用較多?？刂凭w在不同生長期的條件。（營養(yǎng)生長與代謝產物積累時條件不同）操作：菌種先在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖→收集菌體濃縮物→洗滌→添加誘導物的產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)特點：將菌體生長條件（營養(yǎng)期）與產酶條件（自我繁殖期）區(qū)分開來。eg:

酶制劑兩步法液體深層培養(yǎng)第一步是屬有機酸發(fā)酵或氨基酸發(fā)酵。第二步是在微生物產生的某種酶作用下把第一步產物轉化為所需的氨基酸所以又稱為酶轉化法，eg:氨基酸生產的兩步法液體深層培養(yǎng)：工藝繁雜，目前谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸等大多數是利用直接發(fā)酵來生產的三、影響種子質量的主要因素1、培養(yǎng)基：主要是碳源、氮源、無機鹽、生長素和水等。

選用原則：組分簡單，來源豐富，價格便宜，取材方便等。種子培養(yǎng)基是培養(yǎng)菌體的（以菌體增殖為主要目的），應該是糖份少而氮源多些。但種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分趨于一致時，可縮短發(fā)酵生產的周期，但在各成分的數量（原料配比上），應根據培養(yǎng)目的而定。2、種齡與接種量對數生長期為宜，種齡過嫩或過老，都會延長發(fā)酵周期，降低產量。一般以5~10%為宜。3、溫度：溫度直接影響生長和酶的合成

夾套、排管或蛇管，冬季進風還要加熱

當公稱容積在6M3以下時罐采用夾套式。發(fā)酵氣的冷卻或加熱，均由夾套來完成。公稱容積為6M3以上時，發(fā)酵氣的冷卻由立式排管來擔負發(fā)酵罐內排管4、pH值：對