第一節(jié)沙門氏菌檢驗

第一節(jié)沙門氏菌檢驗沙門氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國的各類細菌性食物中毒中,沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。在英國,以沙門氏菌占首位。美國則為第2位,僅次于金色葡萄球菌。日本則以副溶血弧菌和金色葡萄球菌為最多,沙門氏菌占第3位。我國內(nèi)陸地區(qū)也是以沙門氏菌為首位。世界上最大的一起沙門氏菌食物中毒是1953年于瑞典由吃豬肉而引起的鼠傷寒沙門氏菌中毒,7717人中毒,90人死亡。沙門氏菌屬于腸桿菌科,至今已有2230種以上的血清型。概況沙門氏菌引起人的傷寒、副傷寒、感染性腹瀉、食物中毒和醫(yī)院內(nèi)感染，并引起動物的沙門氏菌病，是重要的腸道致病菌。該菌屬在醫(yī)學、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上均十分重要：沙門氏菌的分類根據(jù)新近的沙門氏菌的分類方案，本屬菌現(xiàn)可分為兩個種：腸道沙門氏菌（S.enterica）邦戈爾沙門氏菌（S.bongori）腸道沙門氏菌又分為6個亞種：腸道亞種（enterica）薩拉姆亞種（salamae）亞利桑那亞種（arizonae）雙相亞利桑那沙門氏菌（diarizonae）豪頓沙門氏菌（houtenae）因迪卡沙門氏菌（indica）抗原結(jié)構菌體(O)抗原─分群鞭毛(H)抗原─分型毒力(Vi)抗原─微莢膜成分O抗原是細胞壁表面的耐熱多糖抗原；根據(jù)O抗原（群因子）將沙門氏菌分為A、B、C1-C4、D1-D3、E1-E4、F、G1-G2、H……Z和O51-O63以及O65-O67計51個O群，包括58種O抗原。1、O抗原H抗原是本屬菌的蛋白質(zhì)性鞭毛抗原，計有63種；第一相（特異相）：小寫英文字母，特異性高第二相（非特異相）：阿拉伯數(shù)字，少數(shù)用英文字母，特異性低同一O群的沙門氏菌又根據(jù)它們的H抗原的不同再細分成許多不同的血清型。2、H抗原Vi抗原是微莢膜成分；相當于K抗原，與毒力（virulence）有關，故稱為Vi抗原。新分離的菌株多有Vi抗原，在普通培養(yǎng)基上多次傳代后易丟失此抗原，這種變異稱為“V-W變異”。3、Vi抗原傷寒沙門氏菌丙型副傷寒沙門氏菌部分都柏林沙門氏菌須鑒定Vi抗原4、血清型以O:H:Vi形式表示：用已知的沙門氏菌O和H單因子血清作玻板凝集試驗便可確定一個沙門氏菌分離物的血清型或抗原式，對可能有Vi抗原的菌株還須用Vi抗血清鑒定之。舉例：1,4,[5],12:i:1,29,12,Vi:d:–目前本菌屬至少已有2500個血清型。對人和溫血動物致病的血清型絕大多數(shù)分屬于AF群，在疾病中經(jīng)常出現(xiàn)的不足50種。常用檢驗用培養(yǎng)基DHL瓊脂成分蛋白胨20g牛肉膏3g乳糖

10g蔗糖

10g去氧膽酸鈉1g硫代硫酸鈉2.3g檸檬酸鈉1g檸檬酸鐵銨

1g中性紅0.03g瓊脂1820g蒸餾水1000mlpH7.3制法：將除中性紅和瓊脂以外的成分溶解于400ml蒸餾水中，校正pH，再將瓊脂于600ml蒸餾水中煮沸溶解，兩液合并，并加入0.5%的中性紅水溶液6ml，待冷至55℃，傾注平板。

sal.為無色半透明菌落，產(chǎn)H2S者為黑色菌落。SS瓊脂(沙門氏-志賀氏瓊脂)基礎培養(yǎng)基牛肉膏5g蛋白胨5g三號膽鹽3.5g瓊脂17g蒸餾水1000ml121℃,15min高壓滅菌完全培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基1000ml乳糖

10g檸檬酸鈉8.5g硫代硫酸鈉8.5g10%檸檬酸鐵溶液10ml1%中性紅溶液

2.5ml0.1%煌綠溶液

0.33ml加熱溶化基礎培養(yǎng)基,按比例加入上述除染料以外之各成分,充分混合均勻,矯正至pH7.0,加入中性紅和煌綠溶液,傾注平板.注1:制好的培養(yǎng)基宜當日使用，或保存于冰箱內(nèi)于48h內(nèi)使用注2:煌綠溶液配好后應在10天以內(nèi)使用注3:可以購用SS瓊脂的干燥培養(yǎng)基

sal.為無色半透明菌落，產(chǎn)H2S者為中心帶黑色，乳糖陽性者為粉紅色，中心帶黑色。亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）成分蛋白胨5g乳糖4g亞硒酸氫鈉

4g磷酸氫二鈉5.5g磷酸二氫鉀4.5gL-胱氨酸

0.01g蒸餾水1000ml1%L-胱氨酸–氫氧化鈉溶液的配制：稱取L-胱氨酸0.1g，加1mol/L氫氧化鈉1.5ml，使溶解，再加入蒸餾水8.5ml即成。制法將除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900ml蒸餾水中，加熱煮沸，待冷備用。另將亞硒酸氫鈉溶解于100ml蒸餾水中，加熱煮沸，待冷，以無菌操作與上液混合。再加入1%L-胱氨酸-氫氧化鈉1ml。分裝于滅菌瓶中，每瓶100ml，pH應為7.1氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）甲液胰蛋白胨5g氯化鈉8g磷酸二氫鉀1.6g蒸餾水1000ml乙液氯化鎂40g蒸餾水100ml丙液0.4%孔雀綠水溶液制法分別按上述成分配好后，121℃，15min滅菌備用。臨用前取甲液90ml、乙液9ml、丙液0.9ml，以無菌操作混合即可。四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）基礎培養(yǎng)基蛋白胨5g膽鹽

1g碳酸鈣10g硫代硫酸鈉30g蒸餾水1000ml碘溶液碘6g碘化鉀5g蒸餾水20ml制法將基礎培養(yǎng)基的各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，分裝每瓶100ml。分裝時應隨時振搖，使其中的碳酸鈣混勻。121℃，15min，滅菌。臨用時每100ml基礎培養(yǎng)基中加入碘溶液2ml、0.1%煌綠溶液1ml。亞硫酸鉍瓊脂（BS）成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4g煌綠0.025g檸檬酸鉍銨

2g亞硫酸鈉

6g瓊脂1820g蒸餾水1000mlpH7.5制法將前五種成分溶解于300ml蒸餾水中將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉另用50ml蒸餾水溶解將瓊脂于600ml蒸餾水中煮沸溶解，冷至80℃。將以上三液合并，補充蒸餾水至1000ml，矯正pH，加0.5%煌綠水溶液5ml，搖勻，冷至55℃時，傾注平板注：此培養(yǎng)基不需高壓滅菌。制備過程中不宜過分加熱，以免降低其選擇性。應在臨用前一天制備，貯存于室溫暗處。超過48h不宜使用。產(chǎn)H2S者為黑色有金屬光澤，不產(chǎn)H2S者為灰綠色的菌落。尿素瓊脂成分蛋白胨1g氯化鈉5g葡萄糖5g磷酸二氫鉀2g0.4%酚紅溶液3ml瓊脂20g蒸餾水1000ml20%尿素溶液100mlpH7.2制法將除尿素以外的成分配好，并高壓滅菌后，冷至55℃，加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，最終pH為7.2，分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩Ｔ囼灧椒ㄌ羧…傊囵B(yǎng)物接種，在37℃，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸餾水1000ml1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1mlL-氨基酸或DL-氨基酸0.5g或1g/100mlpH6.8制法將除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶100ml，加入各種氨基酸、賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。試驗方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于37℃，培養(yǎng)18-24h。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應為黃色。ONPG培養(yǎng)基成分鄰硝基酚--D-半乳糖苷（ONPG）60mg0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）10ml1%蛋白胨水（pH7.5）30ml制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于試管內(nèi)，每管0.5ml。用橡皮塞塞緊。試驗方法將細菌接種于37℃培養(yǎng)1-3h和24h觀察結(jié)果。如果-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1-3h變黃色，如無此酶則24h不變色。氫化鉀（KCN）培養(yǎng)基成分蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g蒸餾水1000ml0.5%氫化鉀溶液

20mlpH7.6制法將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121℃，15min。每100ml培養(yǎng)基加入0.5%氰化鉀溶液2.0ml。試驗方法37℃，培養(yǎng)1-2天。如有細菌生長即為陽性（不抑制），經(jīng)2天培養(yǎng)不生長為陰性（抑制）。緩沖蛋白胨水（BP）成分蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）

9g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mlpH7.2制法按上述成分配好后，121℃，15min滅菌。臨用時無菌分裝每瓶225ml。注：本培養(yǎng)基供沙門氏菌前增菌用前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經(jīng)過前增菌。以無菌操作取25g（ml），加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml

廣口瓶內(nèi)。固體食品可先磨碎或乳化，于37℃培養(yǎng)4h（干蛋品1824h）。移取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)1824h。同時，另取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃培養(yǎng)1824h。為何要用兩種不同的增菌液呢？亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）四硫磺酸酸鹽增菌液（TTB）+對豬霍亂和羊流產(chǎn)sal有毒性TTB適于傷寒沙門氏菌增菌；MM適于其它各種沙門氏菌；檢樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品25g+BP225ml直接增菌法：鮮肉、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品25g+滅菌生理鹽水25ml，做成檢樣勻液10ml+MM（或TTB）100ml10ml+SC100ml檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100ml檢樣勻液25ml+SC100mlBSDHL（或SS、HE、WS）挑取可疑菌落TSI，靛基質(zhì)試驗、尿素（pH7.2）、KCN、賴氨酸H2S+；靛基質(zhì)-；尿素-；KCN-；賴氨酸+；H2S+；靛基質(zhì)+；尿素-；KCN-；賴氨酸+；H2S-；靛基質(zhì)+；尿素-；KCN-；賴氨酸+/-；非如左述的各種反應結(jié)果沙門氏菌血清學試驗沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌非沙門氏菌甘露醇+、山梨醇+ONPG+報告42℃18-24h37℃42℃37℃鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。各取25g（25ml）加入滅菌生理鹽水225ml，按前法做成檢樣勻液；取25ml接種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24h；另取25ml接種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃，培養(yǎng)1824h。分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂（BS）和一個DHL瓊脂平板（或SS瓊脂平板）。兩種增菌液可同時劃線接種于同一個平板上。于37℃分別培養(yǎng)1824h或4048h（BS）觀察各個平板上生長的菌落特征。選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸鉍瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落黑色有金屬光澤DHL瓊脂平板無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與前相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色SS瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與前相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色，但中心無黑色形成時與大腸桿菌不能區(qū)別。沙門氏菌屬各群在選擇性瓊脂平板上的菌落特征生化試驗自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂上，只有斜面產(chǎn)酸并同時硫化氫（H2S）陰性的菌株可以排除，其他的反應結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種-++/-+沙門氏菌屬、費勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+++/-+沙門氏菌Ⅲ、費勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-++-沙門氏菌屬、大腸桿菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬-+--傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸桿菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+++/--大腸桿菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、費勞地氏檸檬酸桿菌注：+陽性；-陰性；+/-多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應結(jié)果在接種三糖鐵的同時，再接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀培養(yǎng)基（KCN）和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于37℃培養(yǎng)18-24h，必要時可延長至48h。腸桿菌科各屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1沙門氏菌屬A2沙門氏菌屬（少見）、緩慢愛德華氏菌B1沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬血清型分型鑒定抗原的準備O抗原的鑒定用AF多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照，在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鑒定Vi抗原的鑒定須強調(diào)的是，雖然對沙門氏菌有各種新的分類方案，但通常仍慣用簡單的通用命名，即以該菌所致疾病或最初分離地名、或抗原式三種方式來命名。群別菌型抗原OHA甲型副傷寒沙門氏菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙