X專題課題酵母細(xì)胞的固定化

溫故知新：1、洗衣粉中添加________，可以更有效地清除頑漬。常用的酶制劑有_________________四類。2、影響酶活性的因素有_______、________和_________。在應(yīng)用酶的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了一些實(shí)際問題：酶通常對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。課題3

酵母細(xì)胞的固定化課題背景問1：酶已經(jīng)應(yīng)用于哪些方面，酶制劑有哪些優(yōu)點(diǎn)？人們發(fā)現(xiàn)哪些實(shí)際問題？

如今，酶已經(jīng)大規(guī)模地應(yīng)用于食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域。優(yōu)點(diǎn)：催化效率高、低能耗、低污染等

于是，有人設(shè)想，將酶固定在不溶于水的載體上，使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用?，F(xiàn)代的固定化酶技術(shù)已完全實(shí)現(xiàn)了這一設(shè)想。高果糖漿的生產(chǎn)就是固定化酶技術(shù)成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)例。

課題3

酵母細(xì)胞的固定化問2：面對這些實(shí)際問題，你有什么設(shè)想？課題背景酶是由細(xì)胞合成的，于是，又有人設(shè)想，能否將合成酶的細(xì)胞直接固定?自20世紀(jì)70年代，在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了細(xì)胞固定化技術(shù)。與固定化酶技術(shù)相比，固定化細(xì)胞制備的成本更低，操作更容易。在本課題中，我們就來學(xué)習(xí)酵母細(xì)胞的固定化，了解固定化酶的作用。課題3

酵母細(xì)胞的固定化問3：面對這些實(shí)際問題，進(jìn)一步的設(shè)想與創(chuàng)新？課題背景閱讀與思考（P49~50）1、什么是高果糖漿？與蔗糖比有何優(yōu)點(diǎn)？2、生產(chǎn)高果糖漿需要什么酶？其作用是什么？這種酶有何特點(diǎn)？3、這種酶在應(yīng)用中有什么不足？解決的技術(shù)是？4、高果糖漿生產(chǎn)過程？5、這種方法的優(yōu)點(diǎn)是什么？基礎(chǔ)知識

(一)固定化酶的應(yīng)用實(shí)例1、高果糖漿是果糖含量為42%左右的糖漿。作為蔗糖的替代品，高果糖漿不會像蔗糖那樣誘發(fā)肥胖、糖尿病、齲齒和心血管病，對人的健康更有益。2、生產(chǎn)高果糖漿需要葡萄糖異構(gòu)酶；其作用是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖；這種酶穩(wěn)定性好，可持續(xù)發(fā)揮作用。3、酶溶解于葡萄糖溶液后，就無法從糖漿中回收，造成很大的浪費(fèi)。固定化酶技術(shù)?；A(chǔ)知識

(一)、固定化酶的應(yīng)用實(shí)例問1、什么是高果糖漿？與蔗糖比有何優(yōu)點(diǎn)？（食品生產(chǎn)為什么偏向用果糖不用蔗糖？）問3、這種酶在應(yīng)用中有什么不足？解決的技術(shù)是？問2、生產(chǎn)高果糖漿需什么酶？作用是什么？這種酶有何特點(diǎn)？使用固定化酶技術(shù)，將葡萄糖異構(gòu)酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些酶顆粒裝到一個反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板上的小孔，而反應(yīng)液卻可以自由出入。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應(yīng)柱，與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出基礎(chǔ)知識

(一)、固定化酶的應(yīng)用實(shí)例問4、高果糖漿生產(chǎn)過程？5優(yōu)點(diǎn)是：（1）使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離；（2）固定在載體上的酶可以被反復(fù)利用。反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量?；A(chǔ)知識

(一)固定化酶的應(yīng)用實(shí)例問5、這種方法的優(yōu)點(diǎn)是什么？問：在生產(chǎn)實(shí)際中使用固定化酶技術(shù)有無不足？如有不足，怎么辦?有。一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實(shí)際中很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應(yīng)才能進(jìn)行，所以操作比較麻煩。可采用固定化細(xì)胞技術(shù)。基礎(chǔ)知識（二）固定化細(xì)胞技術(shù)問：固定化酶或固定化細(xì)胞的定義及方法？固定化技術(shù)的定義及方法：固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)，包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法(將酶分子或細(xì)胞相互結(jié)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合到載體上)和物理吸附法。2.將酶或細(xì)胞固定化的方法將酶（或細(xì)胞）包埋在細(xì)微網(wǎng)格里將酶（或細(xì)胞）相互連接起來將酶（或細(xì)胞）吸附在載體表面上包埋法化學(xué)結(jié)合法物理吸附法酶和細(xì)胞固定方法的選擇①酶適合采用化學(xué)結(jié)合和物理吸附法固定②細(xì)胞適合采用包埋法固定（1）、方法（2）、原因①細(xì)胞個大，酶分子很?、趥€體大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合而個小的酶容易從包埋的材料中漏出基礎(chǔ)知識（二）固定化細(xì)胞技術(shù)問：固定化酶和固定化細(xì)胞常用的載體材料？

本課題使用的是包埋法固定化細(xì)胞，即將微生物細(xì)胞均勻地包埋在不溶于水的多孔性載體中。常用的載體有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等。本實(shí)驗選用海藻酸鈉作載體包埋酵母細(xì)胞。1、從操作角度來考慮，你認(rèn)為哪一種方法更容易?2、哪一種方法對酶活性的影響更小?3、固定化細(xì)胞固定的是一種酶還是一系列酶?4、如果想將微生物的發(fā)酵過程變成連續(xù)的酶反應(yīng)，應(yīng)該選擇哪種方法?5、如果反應(yīng)物是大分子物質(zhì)，又應(yīng)該采用哪種方法?實(shí)驗操作（一）制備固定化酵母細(xì)胞閱讀P50~51思考下列問題：（1）、制備過程包括哪幾個步驟？（2）、你認(rèn)為哪個步驟的操作是最重要的一環(huán)？（3）、各步驟應(yīng)當(dāng)分別注意什么問題？1．酵母細(xì)胞的活化2．配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol／L的CaCl2溶液

3．配制海藻酸鈉溶液4．海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合

5．固定化酵母細(xì)胞1、酵母細(xì)胞的活化問：什么是活化？怎樣活化？應(yīng)注意什么？實(shí)驗操作（一）制備固定化酵母細(xì)胞取1g干酵母，放入50ml的小燒杯中，加入蒸餾水10ml，用玻璃棒攪拌，使酵母細(xì)胞混合均勻，成糊狀，放置1h左右使其活化。活化：就是讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)注意事項A、選用的干酵母要具有較強(qiáng)的活性，而且物種單一B、在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)。注意水的用量活化：讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)；本質(zhì)：加快新陳代謝；方法：加入適量的水。

實(shí)驗操作2、配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液稱取無水CaCl20.83g。放人200mL的燒杯中，加入150mL的蒸餾水，使其充分溶解，待用。注意事項溶解物質(zhì)要徹底，勿用自來水溶解，以防自來水中各種離子影響實(shí)驗結(jié)果（一）制備固定化酵母細(xì)胞3、配制海藻酸鈉溶液實(shí)驗操作（一）制備固定化酵母細(xì)胞稱取0.7g海藻酸鈉，放入50mL小燒杯中，加人10mL水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10mL。注意，加熱時要用小火，或者間斷加熱，反復(fù)幾次，直到海藻酸鈉溶化為止。說明：海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少，影響實(shí)驗效果。4、海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入已活化的酵母細(xì)胞，進(jìn)行充分?jǐn)嚢瑁蛊浠炫_均勻，再轉(zhuǎn)移至注射器中實(shí)驗操作（一）制備固定化酵母細(xì)胞注意事項

A、溶化好的海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫，否則會因溫度過高殺死酵母菌B、攪拌要徹底充分，使兩者混合均勻，以免影響實(shí)驗結(jié)果的觀察實(shí)驗操作5、固定化酵母細(xì)胞以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，觀察液滴在CaCl2溶液中形成凝膠珠的情形。將這些凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右如果沒有注射器，可以在小塑料瓶上安裝一個孔徑為2mm的噴嘴來使用。（一）制備固定化酵母細(xì)胞注意事項A、可利用海藻酸鈉制成不含酵母菌的凝膠珠，用作對照B、海藻酸鈉膠體在CaCl2這種電解質(zhì)的作用下，發(fā)生聚沉，形成凝膠珠，需穩(wěn)定30min左右（二）用固定化細(xì)胞發(fā)酵

1、將固定好的酵母細(xì)胞(凝膠珠)用蒸餾水沖洗2-3次。實(shí)驗操作（一）制備固定化酵母細(xì)胞

2、將150mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移到200mL的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細(xì)胞，置于25℃下發(fā)酵24h。注意事項①控制好發(fā)酵溫度，一般是室溫25℃②發(fā)酵時間可視具體情況而定，一般時間稍長一些，效果明顯③可用不含酵母的凝膠珠做相同的處理，對照實(shí)驗結(jié)果海藻酸鈉在水中溶解的速度較慢，需要通過加熱促進(jìn)其溶解。溶解海藻酸鈉，最好采用小火間斷加熱的方法。例如，加熱幾分鐘后，從石棉網(wǎng)上取下燒杯冷卻片刻，并不斷攪拌，再將燒杯放回石棉網(wǎng)繼續(xù)加熱，如此重復(fù)數(shù)次，直至海藻酸鈉完全溶化。如果加熱太快，海藻酸鈉會發(fā)生焦糊。操作提示（一）觀察凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。（二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味。1．觀察并描述形成的凝膠珠的顏色和形狀。2．觀察利用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵的葡萄糖溶液，看看是否有氣泡產(chǎn)生，聞聞是否有酒味。結(jié)果分析與評價剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法。一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實(shí)驗桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實(shí)驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會混在產(chǎn)物中，