majun-基因工程-分子基本操作技術

第四章分子基本操作技術生物科學與技術學院核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質結合的方式存在的真核生物95%的DNA存在于細胞核內，5%的DNA在細胞器75%的RNA存在于細胞質，10%在核內，15%在細胞器其中rRNA（80～85%）tRNA及核內小分子RNA（10～15%）mRNA（1～5%）第一節(jié)DNA的基本操作技術DNA提取原則保證DNA結構的完整性純化后不應存在對酶有抑制作用的物質排除有機溶劑和金屬離子的污染蛋白質、多糖、脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的幾種方法1、染色體DNA的提取CTAB法SDS法其它2、非染色體DNA的提取質粒DNA的提取，包括堿裂解法和煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取，主要是差速離心結合SDS裂解法基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃

時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15℃。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除

CTAB提取緩沖液的改進配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法

SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細胞裂解方式的不同有：吸附材料結合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質材料陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。質粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質粒DNA溶液DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質粒DNA的提取菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取質粒DNA的提取蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質粒DNA的提取基因組DNA的檢測

提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質量的基因組DNA帶型單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；

A260/280約為1.8DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留

原因對策重新純化DNA，過吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等雜質重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）加入RNase降解RNA問題二：DNA降解。材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融

原因對策盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量，細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融問題三：DNA提取量少。實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時DNA丟失

原因對策盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁。高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）。增加吸附的時間，或低溫沉淀小心操作第二節(jié)RNA基本操作技術分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應的蛋白產物RNA的不穩(wěn)定性核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不易失活提取RNA的注意事項經(jīng)常更換新手套。因為皮膚和實驗室用品上可能有RNase，會導致RNase污染。使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。RNA提取的步驟材料的裂解雜質的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機相。硅質材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC處理的水溶解RNA材料準備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細胞及血液應盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質少的部位,細菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。雜質的抽提采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間，使蛋白質、多糖和DNA分布到中間層和有機相中，RNA留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質層，可以再次用有機溶劑抽提RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質或使用異丙醇沉淀RNA應充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或專門的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時應置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測（A260=1，約40μg/mLRNA；

A260/A280

約為1.9-2.1）RNA提取常見問題1抽提過程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染2DNA的污染

3離子濃度較高

原因對策1保證徹底的裂解和一定轉數(shù)一定時間的離心；增加有機溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化2減少處理樣品的量；加入不含RNase的DNase處理；再次純化3增加漂洗次數(shù)問題一：RNA樣品不純1樣品含有雜質雜液2樣品過量或樣品裂解和勻漿不徹底3RNA未有效的吸附沉淀或洗脫4樣品RNA含量少

原因對策1去除樣品中的雜質，