多糖的提取分離純化和結(jié)構(gòu)分析

多糖的提取、分離純化和

結(jié)構(gòu)分析一、前言

多糖和蛋白質(zhì)、基因是生命科學(xué)的三大領(lǐng)域，是自然界含量豐富的物質(zhì)，也是與人類生活緊密相關(guān)的一類生物高分子。大量研究表明，多糖具有其獨特的生物活性，是許多天然產(chǎn)物的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等功效。多糖的提取、分離和純化是研究多糖結(jié)構(gòu)和活性的基礎(chǔ)，只有得到相對純度較高的多糖組分，才能更好地分析其結(jié)構(gòu)，從而探究其重要的生理功能。多糖的提取

雖然多糖的來源不同，但其提取、分離和純化的方法是基本一致的。天然原料粉碎后，先經(jīng)過乙醚或石油醚回流萃取的脫脂處理，再在熱水中浸提得到水溶性的組分，經(jīng)乙醇反復(fù)沉淀、脫色和脫蛋白后，透析去除小分子雜質(zhì)，從而得到多糖的粗品；粗多糖再經(jīng)過離子交換柱和凝膠柱的分級純化后得到不同組分的多糖純品，可用于進一步的結(jié)構(gòu)和活性研究。多糖的提取提?。簩⒍嗵腔衔飶纳矬w內(nèi)分離出來的過程。提取一般采用溶劑抽提，所依據(jù)的原理是極性相似相溶原理，先將原料用乙醇或自主回流脫脂后，根據(jù)多糖的特性用水、稀堿或稀酸提取，同一原料，用水、酸、堿提取得到的多糖成分是不盡相同的。為防止多糖中糖苷鍵的斷裂，提取應(yīng)盡量避免在酸性條件下進行，如用酸提，提取時間宜短，溫度不超過50oC；多糖的提取

稀堿提取時，常需要通入氮氣或加入硼氫化鈉或硼氫化鉀，以防止多糖降解。為了提高提取的選擇性，盡量使雜質(zhì)的溶解度降到最低限度，通常在提取液中加入某些物質(zhì)，如乙酸、乙醇、苯酚、鹽類等物質(zhì)；為了增加提取效率，縮短提取時間，還可以在提取過程中使用超聲波、微波或一些酶進行輔助提取，但需要注意的是，外加的物理場或酶處理會對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。多糖的分離純化（1）多糖的初步分離純化：多糖的分離和醇化是出去多糖粗提物中非多糖組分并得到單一的多糖組分，經(jīng)過有機溶劑沉淀得到的粗多糖一般含有一些游離的蛋白質(zhì)和一些小分子，因而需先對粗多糖進行初步的分離純化。脫蛋白質(zhì)方法包括：醇洗或丙酮洗Sevag法三氟三氯乙烷法

三氯醋酸法脫酚類化合物方法包括：弱堿性樹脂DEAE-纖維素或DuoliteA-7吸附色素氧化脫色法(濃氨水、pH8、50oC、過氧化氫、2h)多糖的分離純化（2）多糖的分級純化：經(jīng)脫色、脫蛋白和透析等處理得到的粗多糖大多是由幾種多糖所組成的，因此應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒▽Υ痔嵛镞M行分離純化，將混合多糖分離成為單一多糖。

目前，用于多糖分離純化的手段主要有包括：分步沉淀法、季銨鹽沉淀法、鹽析法、金屬配合物法、柱色譜分離法、超濾法和電泳法。國內(nèi)外，應(yīng)用比較廣泛的主要是超濾法和柱色譜分離法。多糖的分離純化超濾法：在常規(guī)微粒過濾的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的細微粒子過濾技術(shù)，是膜法分離的一種，其原理是，不同孔徑的超過濾膜排阻不同分子量和形狀的多糖而得到分離。規(guī)格：超濾孔徑1~100nm，截留分子量103~106特點：受滲透壓的阻礙作用小，在相當(dāng)?shù)偷膲毫Σ?0.04~0.7MPa)下保持高流通率。應(yīng)用：各類多糖的分離、濃縮、純化優(yōu)點：收率高、不易破壞多糖生物活性、能耗低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。多糖的分離純化柱色譜法：一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相(固定相和流動相)中，使各組分以不同速度移動而分離。規(guī)格：根據(jù)其電荷性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點選擇，常用柱色譜包括離子交換色譜柱和凝膠柱色譜。特點：分離效率高、設(shè)備簡單、操作方便、條件溫和、不易造成物質(zhì)變性等優(yōu)點。應(yīng)用：物質(zhì)分離純化、分析鑒定最重要的方法之一；分離/有機化合物及生物大分子不可缺少的手段。多糖的結(jié)構(gòu)分析多糖的結(jié)構(gòu)：多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，多糖的結(jié)構(gòu)分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化學(xué)的核心所在。

與蛋白質(zhì)、核酸大分子相比，糖鏈的結(jié)構(gòu)也包括一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和二級以上的高級結(jié)構(gòu)，但其結(jié)構(gòu)的含義和內(nèi)容都較蛋白質(zhì)、核酸要復(fù)雜和豐富得多。多糖的結(jié)構(gòu)分析糖鏈結(jié)構(gòu)的研究基礎(chǔ)是一級結(jié)構(gòu)：

1、糖鏈中糖殘基的種類、環(huán)型及分子數(shù)比例；2、糖鏈的分子量；3、糖鏈中糖殘基之間的連接位置；4、糖鏈中糖殘基之間的連接順序；5、糖鏈中每個糖殘基的構(gòu)型；6、糖鏈分支點的位置、分支點上糖殘基結(jié)構(gòu)；7、糖鏈復(fù)合物中的糖鏈與非糖部分的連接點結(jié)構(gòu)。多糖的結(jié)構(gòu)分析1、糖鏈中糖殘基的種類和及分子比多糖完全酸水解部分酸水解乙酰解和甲醇解單糖糖鏈片段乙?；嗵羌柞；嗵羌埳VPC薄層色譜TLCGCHPLC離子色譜中和過濾衍生多糖的結(jié)構(gòu)分析2、多糖分子量的測定經(jīng)典的測定高分子化合物分子量的許多物理方法均適用于多糖類分子量的測定，如滲透壓法、蒸汽壓滲透計法、端基法、HPLC、黏度法、凝膠色譜法和超濾法等，其中目前公認較好的方法是高效凝膠滲透色譜（HPGPC）。高效凝膠滲透色譜又稱高效尺寸排阻色譜（HPSEC）、高效凝膠色譜，是一種高分子領(lǐng)域的高效分離分析技術(shù)，是研究高分子的分子量及合成高分子分子量分布及與分子線團尺寸相關(guān)的結(jié)構(gòu)、反應(yīng)、物性的最有效的手段之一。常用的商品柱有Bondagel和TSK柱系。多糖的結(jié)構(gòu)分析3、糖鏈中糖殘基間的連接位置分析（1）甲基化分析方法：確定糖鏈中糖基間的連接位置常用方法。該法首先將多糖鏈全甲基化，使所有的游離羥基變?yōu)榧籽趸Ｄ壳白畛Ｓ玫募谆椒ㄊ歉牧糎akomori法。Hakomori法先將樣品溶于無水二甲基亞砜中，然后與甲基亞磺酰甲基鈉SMSM反應(yīng)，使得多糖上游離羥基離子化，多糖成為陰離子后，易于CH3I反應(yīng)，該法通常需重復(fù)數(shù)次。以α-(1-4)葡聚糖為例說明甲基化過程。多糖的結(jié)構(gòu)分析3、糖鏈中糖殘基間的連接位置分析（2）酶水解法：由于酶促反應(yīng)具有高度專一性且副產(chǎn)物少的特點，酶水解法是糖鏈的結(jié)構(gòu)分析中的一種重要手段，利用α-糖苷酶和β-糖苷酶對多糖底物的催化反應(yīng)來確認多糖鏈中糖苷鍵類型，還可以利用酶學(xué)方法分析糖肽連接方式。

美國Maley和Tarention發(fā)現(xiàn)內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶作為稀釋放酰胺連接的糖鏈的工具酶，為研究與天冬酰胺連接的寡糖結(jié)構(gòu)開辟了新紀元。多糖的結(jié)構(gòu)分析4、糖鏈中糖殘基連接順序分析（1）化學(xué)水解法（2）高碘酸氧化法和Smith降解（3）光譜學(xué)法（MS和NMR）多糖的結(jié)構(gòu)分析（1）化學(xué)水解法最初用化學(xué)降解法，如稀酸（含有機酸）緩和水解，部分酸水解，也可用乙酰解、堿水解和酸解，將糖鏈水解成較小的片段（各種低聚糖），利用柱色譜分離、純化，分別測定這些低聚糖的結(jié)構(gòu)，分析其連接順序，從而可推斷出整個糖鏈（或重復(fù)單位）的連接順序。由于水解方法各不相同，作用的糖苷鍵也不同，因為生成的低聚糖亦各不相同，這有利于分析與判斷糖鏈中糖殘基間的連接順序。例如，利用甲基化分析方法得知黑霉多糖有等量的α-(1-3)和α-(1-4)連接的D-吡喃葡萄糖，水解得到麥芽糖、黑霉糖和兩種三糖，但無麥芽糖和黑霉三糖。多糖的結(jié)構(gòu)分析（2）高碘酸氧化法和Smith降解法高碘酸可以選擇性地氧化斷裂糖分子中的連二羥基或連三羥基處，生成相應(yīng)的多糖醛、甲酸，反應(yīng)定量地進行。1-2，1-4鍵合，每糖基消耗1分子高碘酸，無甲酸生成；1-6鍵合，每糖基消耗2分子高碘酸，生成1分子甲酸；1-3鍵合，不能被高碘酸氧化。反應(yīng)必須在控制的條件下進行，以避免副反應(yīng)的產(chǎn)生。一般使多糖與最小量的高碘酸反應(yīng)，溶液pH控制在3～5，且避光、低溫，同時需做空白實驗。Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進行酸水解或部分水解。高碘酸氧化后生成不同的產(chǎn)物，降解產(chǎn)物得更多信息。多糖的結(jié)構(gòu)分析（3）質(zhì)譜MS法20世紀50年代，因糖的難揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性，限制了電子轟擊質(zhì)譜(EI-MS)對多糖的研究。糖的衍生化方法能提高其揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，用于結(jié)構(gòu)解析，但對于聚合度高的多糖仍存在上述問題。近年來發(fā)展了各種軟電離技術(shù)，如化學(xué)電離CI、場致電離FI、場解析電離FD、化學(xué)解析或直接化學(xué)電離DCI、快速電子轟擊法FAB以及電噴霧電離質(zhì)譜ESI-MS和基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜MALDI-MS、用飛行時間TOF檢測器來檢測。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)如聯(lián)動掃描、MS/MS方法、不同衍生化處理、同位素標記方法、GC-MS和LC-MS以及各種軟電離技術(shù)的配合使用，在序列分析中越來越重要。多糖的結(jié)構(gòu)分析5、糖苷鍵的構(gòu)型、環(huán)型分析（1）紅外光譜（2）核磁共振多糖的結(jié)構(gòu)分析（1）紅外光譜法不同糖的鑒別：吡喃糖α-D-葡萄吡喃糖855~833cm-1、β-D-葡萄吡喃糖905~876cm-1，α-D-半乳吡喃糖839~810cm-1、β-D-半乳吡喃糖914~886cm-1，α-L-甘露吡喃糖843~818cm-1、β-D-甘露吡喃糖898~888cm-1，β-D-阿拉伯吡喃糖和β-L-阿拉伯吡喃糖898~888cm-1，α-D-木吡喃糖839~810cm-1。吡喃糖和呋喃糖的鑒別：D-葡萄吡喃糖的C-O-C骨架非對稱和對稱伸縮振動分別在917和770cm-1左右；而呋喃環(huán)相應(yīng)吸收峰在924和879cm-1左右。多糖的結(jié)構(gòu)分析（1）紅外光譜法糖苷鍵及糖構(gòu)型的確定：α-D-(1-4)和α-D-(1-3)交替結(jié)合，隨聚合度的增加，環(huán)伸縮振動的吸收峰向高波數(shù)移動，而大多數(shù)是α-D-(1-6)結(jié)合鍵的葡聚糖和異麥芽糖沒有明顯移動。此外，甘露吡喃糖、半乳吡喃糖在875cm-1有新的吸收峰，甘露糖還有810cm-1特征吸收峰。糖鍵上主要取代基的鑒別：氫鍵3600~3200cm-1出現(xiàn)一寬峰；?；蛎鸦?，這組峰消失。一般來說，分子內(nèi)氫鍵在3560cm-1左右，分子間氫鍵在3400cm-1以下。磷酸基在1300~1250cm-1有P=O伸縮振動，磺酸基在1240cm-1有S=O伸縮振動，酰胺1650和1550cm-1。多糖的結(jié)構(gòu)分析（2）核磁共振NMR法1970s引入多糖結(jié)構(gòu)研究