多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段(上課)

參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸一、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_____為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。2．原理1)DNA的熱變性：在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA_________結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開，這個(gè)過(guò)程稱為_____。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。2)子鏈的合成：①需要______；②合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA雙螺旋變性引物3、PCR反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為____、復(fù)性和延伸三步。（1）變性：當(dāng)溫度上升到______以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。（2）復(fù)性：溫度下降到_______左右，兩種引物通過(guò)________________與兩條單鏈DNA結(jié)合。（3）延伸：溫度上升到_____左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在_______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。變性90

℃50

℃堿基互補(bǔ)配對(duì)72

℃DNA聚合酶1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1～3步30輪DNA復(fù)制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復(fù)性（退火）

→

延伸PCR的反應(yīng)過(guò)程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)（220）倍以上。三、PCR實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL3、微量移液器

用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上是能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器PCR擴(kuò)增儀PCR擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過(guò)自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。4、離心機(jī)一種通過(guò)高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設(shè)備。（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測(cè)定：稀釋→對(duì)照調(diào)零→測(cè)定→計(jì)算50倍蒸餾水做對(duì)照波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理

可以通過(guò)測(cè)量DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)光吸收波長(zhǎng)／nm2602402202800.10.22、過(guò)程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值③測(cè)定并計(jì)算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過(guò)程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算練習(xí)鞏固：1.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是

A.反復(fù)洗滌B.不