民院-檢驗核醫(yī)學(放射免疫分析和免疫放射分析)

檢驗核醫(yī)學第六章體外分析技術Invitroanalysistechniques概述

體外分析技術（invitroanalysistechniques）

1.廣義地講，是泛指以離體組織、血液或體液等作為生物樣本，在人體外進行的、分析樣本中成分或其含量的檢測技術。以體外放射性核素標記配體（ligand）為示蹤劑，以結合反應為基礎，以放射性測量為定量手段，在試管中進行的對微量生物活性物質進行定量分析的標記免疫分析技術。主要指放射免疫分析技術（radioimmunoassay,RIA）

2.主要檢測放射性核素發(fā)射的γ射線量第一節(jié)放射免疫分析一、基本原理1.放射免疫分析（RIA）是利用放射性標記的抗原（*Ag）與非標記抗原（Ag）同時與限量的特異性抗體（Ab）進行可逆性競爭性免疫結合反應。

*Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag+Ag

Ag-Ab+Ag*Ag和Ab量恒定2.標準曲線:利用一系列已知濃度的標準Ag(即標準品)與待測樣品在相同條件下反應后，用放射計數儀測定*Ag–Ab(B)或游離的*Ag

（F）的放射性。以各濃度點測量的相應的放射性計數（cpm）或用計算參數[B/(B+F),B/F或B/B0]為縱坐標作圖繪制標準曲線。a)Ab和*Ag

的量恒定

b)抗原抗體反應為可逆性

c)Ab和*Ag

的性質與結構相同特點

1.靈敏度高最小可測量為10-9-10-15g2.特異性強利用專一性強的結合反應

3.精確度好有效的質量控制方法

4.放射性不引入體內

5.所需待測樣品少50-200l6.試劑藥盒化，操作簡便、快速

7.測量微機化，方便、快捷，客觀、準確類型

競爭性體外放射分析

標記物結合劑

放射免疫分析*AgAb(RIA)

競爭蛋白結合分析*Ag血漿中固有的

(CPBA)激素載體蛋白

(TBG)

放射受體分析*LR(RRA)

放射酶分析*SE(REA)

非競爭性體外放射分析

免疫放射分析*Ab*Ab(IRMA)

受體的放射分析*LR(RBA)

酶的放射分析*SE(ERA)放射免疫分析(RIA)基本原理1RIA反應式分離劑*Ag+Ab

*Ag-Ab

*Ag-Ab

+分離劑

AgAg-Ab

Ag-Ab

1)一定量*Ag、不定量Ag與限量Ab進行競爭抑制結合反應2)*Ag-Ab

與Ag成負相關關系(反比)3)在實際工作中，用一系列已知濃度的Ag(標準品)進行實驗制備劑量反應曲線(標準曲線，[*Ag-Ab]－[Ag]曲線)，未知樣品在相同條件下實驗，其濃度通過標準曲線查出2RIA數學函數式

k1Ag+Ab

Ag-Abk2P+QPQP=[Ag]+[*Ag]P0=[Ag0]+[*Ag0]Q=[Ab]Q0=[Ab0]PQ=[Ag-Ab]+[*Ag-Ab]k1[PQ][PQ]K=——=————=———————(1)k2[P][Q][P]([Q0]-[PQ])[PQ]=———————(2)([P0]-[PQ])[Q]

將B=

[PQ]/[P0]、B/F=B/(1-B)=[PQ]/[P]代入(1)B1K=———×———————(3)展開重排

1–B[Q0]-B[P0]

[Q0]1[Q0]

B2–B(1+———+———)+———=0(4)[P0]K[P0][P0]

將B=1-F代入(3)

[Q0]11

F2–F(1-———-———)+———=0(5)[P0]K[P0]K[P0]

定義R=B/F，由B+F=1得B=R/(1+R)代入(3)

R2+R(1+K[P0]–K[Q0])–K[Q0]=0(6)3RIA劑量反應曲線4方法流程

加樣→溫育→分離→測定→數據處理→簽發(fā)檢測報告基本試劑

1標準抗原(Ag)2標記抗原(*Ag)3抗血清(抗體，Ab)1標準抗原(Ag)

已知含量的非標記抗原用途(1)免疫動物，制備抗體

(2)制備標記抗原

(3)作為標準品參與RIA反應，繪制劑量反應曲線

要求(1)質量上高純度與被測抗原屬同一物質，具有相同的免疫(生物)活性，高度純化

(2)數量上高準確度分一級標準(國家或國際標準)

二級標準(廠家或實驗室標準)(3)穩(wěn)定性好，便于貯存、運輸和使用2抗血清(抗體，Ab)

含有抗體的血清質量指標(1)親和力

(2)交叉反應率

(3)滴度(1)親和力

Ab與Ag的結合能力，用親和常數K表示

Scatchard作圖法得：

B/F=K[Q0]–K[PQ]

為一直線

K=直線斜率

K>109L/mol(2)交叉反應率

Ab與Ag類似物的結合程度，表示Ab的特異性。分別用Ag和Ag類似物（Ag#）作劑量反應曲線

Ab與*Ag結合被抑制50%時[Ag]量交叉反應率=

Ab與*Ag結合

被抑制50%時[Ag#]量(3)滴度又稱效價，反映與一定量

Ag特異結合的Ab的濃度,用稀釋度表示用一定量標記Ag與不同稀釋度的Ab反應，作B%-Ab稀釋度曲線，B%=50%時對應的Ab稀釋度即為Ab滴度,

合適的滴度為1:104-1063標記Ag

常用125I和3H標記化合物要求：

(1)適當高的放射性比活度影響方法的靈敏度和精密度，標記Ag化學量≤被測Ag的最小量

(2)放射化學純度>95%影響方法的靈敏度

(3)免疫活性與未標記Ag基本保持一致

(4)穩(wěn)定性好，在一定條件下，穩(wěn)定期1-3月標記Ag與Ab的用量對測定的影響

(1)待測Ag含量較高*Ag的比活度↓Ab的滴度↓靈敏度↓曲線范圍↑

(2)待測Ag含量較低*Ag的比活度↑Ab的滴度↑靈敏度↑曲線范圍↓分離技術1非特異性

(1)吸附法分離劑：葡聚糖凝膠包被活性炭(DCC)F被吸附沉淀，重復性差

(2)沉淀法分離劑：聚乙二醇(PEG)B被沉淀，分離迅速，非特異結合率高

(3)抽濾法常用濾膜：玻璃纖維濾膜、微孔濾膜

B與F的分子量差別明顯時分離效果好2特異性分離方法

(1)雙抗體法分離劑：第二抗體(抗抗體，Ab2)

分離時間長，非特異結合率低

(2)雙抗體+PEG法分離迅速，非特異結合率低

(3)固相分離法固相材料包被Ab1、Ab2

固相材料：纖維素(包被珠)

試管(包被管)

磁化顆粒分析方法1反應方式(1)平衡加樣法：標準(待測)Ag+Ab+標記

Ag→溫育→分離→測定(2)順序加樣法：標準(待測)Ag+Ab→溫育→+標記Ag→溫育→分離→測定提高方法靈敏度的分析方法2反應介質

Tris-HCl或PB緩沖液，pH7.4-7.8

離子強度0.05-0.1M3反應溫度和時間

K大，37?C，1-3h；K小，4?C，過夜4血樣的采集與保存

(1)大都采用原樣品(血清、血漿)，少數需經提取

(2)不及時分析的樣品需分離出血清或血漿，-20?C存放

(3)采樣或反應時常用抗凝劑：EDTA-Na2，防腐劑：

NaN3，穩(wěn)定劑：0.5%BSA、0.1%明膠、抑肽酶等RIA反應管類型

組類型基本反應試劑分離別名稱常用符號AgAb*Ag試劑

總放射性管T--√-

標準非特異結合管N--√√

曲線組最大結合管B0(S0)-√√√

標準管Si√√√√

樣品組樣品管U√√√√

質控組質控管QC√√√√數據處理

1B%—D曲線

2B%—LogD

半對數反“S”曲線

3B/B0%—LogD

半對數反“S”曲線

4LogitB/B0—LogD

全對數直線

5四參數或五參數Logistic模型曲線

6四參數單位點質量作用模型曲線

RIA的質量控制質量控制的目的對分析工作中產生的誤差進行檢查和質量判斷，對出現(xiàn)的質量異常現(xiàn)象尋找原因并采取糾正措施，以保證分析誤差被控制在允許的范圍內。杜絕過失誤差，校正系統(tǒng)誤差，控制隨機誤差。質量控制的內容(任務)1實驗室內部質量控制(1)批內質控精密度評價偏差分析

(2)批間質控精密度評價偏差分析2實驗室外部質量控制(1)對某種分析方法的試劑或試劑盒進行綜合評價

(2)對不同實驗室的分析工作質量進行比較質量控制樣品質控的“標準系統(tǒng)”－質控血清(QC)要求：1QC樣品與待測樣品性質相同

2QC樣品與待測樣品中待測物相同，免疫活性一致

3QC樣品中待測物量已知，分高、中、低三檔濃度

4足量制備，分裝，低溫存放，分批使用制備方法：1按三檔濃度收集多余病人血清，測定標示值

2在緩沖溶液中加入無待測物的蛋白質，再溶入三檔濃度待測物標準品，測定標示值使用方法：QC樣品組數＝√待測樣品總數/3

以組為單位在待測樣品中前、中、后放置測定質量控制指標1靈敏度能檢測出與B0管具統(tǒng)計差別的最小可測量

(1)B0%-2SD的相應劑量(2)B0%-10%的相應劑量

(3)由精密度圖得出2特異性抗體識別其抗原的能力，用交叉反應率表示3精密度在相同條件下，對某一樣品多次檢測所得結果的符合程度，評價隨機誤差∑(Xi–X)2

|X1–X2|SD=———————n=2時，SD=—————n–1√24偏差測定值偏離真值的程度，評價系統(tǒng)誤差準確度測定值與真值的符合程度，評價系統(tǒng)誤差和隨機誤差測定值-真值偏差b=———————X100%

真值準確度=√偏差2+精密度2=√b2+SD25穩(wěn)定性批間的重復性

B0%、NSB%、ED25、ED50、ED75、QC樣品測定值6臨床有效性一項分析方法完成臨床目的的程度正常值及其范圍、正常值與異常值交叉范圍、診斷符合率(陽性率、陰性率、假陽性率、假陰性率)實驗室內部質量控制方法1對實驗數據進行審核剔除“壞點”2劑量反應曲線擬合及質量審核3精密度評價(1)反應誤差關系RER

從多批實驗資料求出直線方程式

SDR=a+bRa反映分離誤差b反映加樣誤差(2)精密度圖(P-P圖)

(用劑量反應曲線)

通過RER將SDR轉換SDD(CVD%)

作SDD(CVD%)-lgD曲線CVD%≤10%4偏差與準確度評價

(1)回收實驗反映偏差測定值-空白值回收率%=—————X100%

已知值回收率%=100%±10%(2)健全性試驗用標準品和樣品分別作劑量反應曲線和樣品稀釋曲線，兩條曲線應平行

(3)二樣本-Youden圖反映準確度，用QC樣品

QC首-QC尾曲線，誤差≤±2SD5穩(wěn)定性評價批間質控，用QC樣品

(1)Cusum圖每批QC測定值與靶值的差累計后按批次連續(xù)作圖，折線兩端落差≤±5SD(2)質控圖

QC測定值-批次曲線，誤差≤±3SD評價

1三種濃度<2SD，雙向（±

）或兩種濃度<2SD，一種<3SD，雙向正常

2三種濃度>2SD，但<3SD，雙向或一種>3SD，雙向隨機誤差大

3三種濃度中一種>3SD，兩種>2SD，三種>1SD，單向（＋或－）系統(tǒng)誤差大免疫放射分析(IRMA)基本原理1IRMA反應式

(1)單位點Ag+*Ab

?Ag-*Ab+*Ab

SP-AgAg-*Ab+SP-Ag-*Ab

(2)雙位點SP-Ab1+Ag?SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2SP：表示固相2IRMA數學函數式

k1Ag+*Ab

Ag-*Abk2P+QPQP=[Ag]P0=[Ag0]Q=[*Ab]Q0=[*Ab0]PQ=[Ag-*Ab]=Bk1[PQ][PQ]K=—=———=——————————k2[P][Q]([P0]-[PQ])([Q0]-[PQ])B=————————展開重排

([P0]-B)([Q0]-B)

B2–B([P0]+[Q0]+1/K)+[P0][Q0]=03劑量反應曲線方法分類1雙抗體夾心法（1）SP-Ab1+Ag?SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（2）Ag+*Ab2

?Ag-*Ab2+*Ab2

SP-Ab1SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（3）SP-Ab1+Ag+*Ab2

?SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab22標記第三抗體

SP-Ab1+Ag+Ab2

SP-Ab1-Ag-Ab2

*Ab3

SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3*Ab3：第三抗體（抗抗體），為兔（豚鼠）抗小鼠IgG抗血清優(yōu)點：通用性標記抗體3雙標記抗體法*Ab2*Ab2SP-Ab1+AgSP-Ab1-AgSP-Ab1-Ag*Ab3*Ab3

優(yōu)點：放射性比活度提高，就提高了方法的靈敏度和精密度影響免疫放射分析的主要因素1被測抗原的性質雙位點IRMA要求被測抗原有兩個以上的結合位點，方法局限于多肽和蛋白質抗原的分析2結合在固相抗體上的抗原穩(wěn)定性被結合的抗原數量較多時，抗原從固相抗體上分離的傾向更明顯高濃度的準確度較低濃度差3反應時間和溫度室溫或4?C，24h；37?C，1.5-3h4標記抗體的濃度標記抗體↑，測定范圍↑，NSB↑5固相物的洗滌洗滌↓，CPM↑，洗滌↑，CPM↓6血清等的非特異性效應溫度↑，血清效應↑IRMA反應管類型組類型基本反應試劑分離別名稱常用符號Ag*Ab

試劑

總放射性管T-√-

標準非特異結合管N(S0)-√√

曲線組