核酸的化學(xué)3學(xué)分

第五章核酸的化學(xué)核酸的種類、分布、功能核酸的組成成分DNA的結(jié)構(gòu)RNA的結(jié)構(gòu)和功能核酸的性質(zhì)核酸的序列測定1868年，瑞士Miescher發(fā)現(xiàn)核酸。1889年，Altmann提出核酸概念。1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，是20世紀(jì)自然科學(xué)最偉大成就之一。1958年，Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則，并于1971年修改了該法則。1961年，Jacob和Monod提出操縱子學(xué)說1966年，Nirenberg等破譯出遺傳密碼1981年，Cech發(fā)現(xiàn)核酶（Ribozyme）1983年，Simons等發(fā)現(xiàn)反義RNA20世紀(jì)70年代，誕生DNA重組技術(shù)。并誕生基因工程。20世紀(jì)90年代開始實施人類基因組計劃，開始進行基因組學(xué)研究。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)空前發(fā)展。核酸的研究歷程20世紀(jì)40年代末，Avery的“肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化”實驗證明DNA是有機體的遺傳物質(zhì)：DNA無莢膜，不致病溫育有莢膜，致病傳代傳代有莢膜，致病有莢膜，致病有莢膜，致病一、核酸的種類、分布、功能Ⅰ種類脫氧核糖核酸（DNA）：是主要的遺傳物質(zhì)。核糖核酸（RNA）

tRNA

(15%)mRNA

(3-5%)

rRNA

(80%)

其它RNA：如反義RNA等

所有生物細(xì)胞都含有DNA和RNA這兩類核酸，而病毒只含DNA或RNA。

Ⅱ分布p473DNA原核生物真核生物擬核質(zhì)粒染色體（質(zhì)）細(xì)胞器：如線粒體、葉綠體等RNA：核內(nèi)（snRNA、hnRNA）、胞質(zhì)(scRNA)、細(xì)胞器

Ⅲ功能p475DNA：是主要的遺傳物質(zhì)，遺傳信息以密碼形式編碼在核酸分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列。RNA參與蛋白質(zhì)合成tRNA：轉(zhuǎn)運、識別rRNA：裝配、催化mRNA：信使、模板多種細(xì)胞功能——參與基因表達(dá)的信息加工和調(diào)節(jié)

真核生物染色體DNA是線型雙鏈DNA。原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒DNA和真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈DNA。細(xì)胞RNA通常都是線型單鏈，但病毒RNA則有線型與環(huán)狀、雙鏈與單鏈之分。RNA的5種功能控制蛋白質(zhì)合成作用于RNA轉(zhuǎn)錄后加工與修飾基因表達(dá)與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)：如反義RNA、RNAi（RNA干擾）生物催化與細(xì)胞持家功能（細(xì)胞基本功能）遺傳信息的加工與進化

生物體通過DNA復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代。通過RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯使遺傳信息在子代中得以表達(dá)。－基因表達(dá)二、核酸的組成成分p478核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase

嘧啶堿pyrimidinebase（堿基base）核糖ribose

(或脫氧核糖deoxyribose)

（戊糖amylsugar）核酸是由核苷酸組成，含磷較多，酸性較強的高分子化合物。（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖+H+糠醛甲基間苯二酚(地衣酚)FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍(lán)色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤PuNH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶Py123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPOPO--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內(nèi)能量代謝中的作用：ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成第二信使——cAMPHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHHAO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA脫氧核苷酸的序列常被認(rèn)為是堿基序列（basesequence)。通常堿基序列由DNA鏈5′→3′方向?qū)?。（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)三、DNA的結(jié)構(gòu)DNA的四級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：由多個脫氧核苷酸分子通過3’，5’—磷酸二酯鍵連接形成的直線型或環(huán)型多聚體。二級結(jié)構(gòu)：在堿基互補配對的基礎(chǔ)上形成的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)：在二級結(jié)構(gòu)上，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)通過折疊和扭曲所形成的特定構(gòu)象。如超螺旋等。四級結(jié)構(gòu)：指DNA與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。如染色體（質(zhì)）。1.雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)（1）Wilkins和Franklin發(fā)現(xiàn)不同來源的DNA纖維具有相似的X射線衍射圖譜。（2）Chargaff規(guī)則——在雙鏈DNA分子中，堿基摩爾數(shù)存在下列關(guān)系：①A=T②G=C③A+C=G+T④A+G=T+C

（3）電位滴定證明，嘌呤與嘧啶的可解離基團由氫鍵連接。后Pauling和Corey發(fā)現(xiàn)A與T生成2個氫鍵、C與G生成3個氫鍵。2.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點p486（1）主鏈：兩條多核苷酸鏈反向平行。兩條鏈均為右手螺旋。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行；（2）堿基：堿基位于內(nèi)側(cè)，堿基互補配對，A與T、G與C配對。（3）螺距：雙螺旋每轉(zhuǎn)一周有10個bp，螺距3.4nm，直徑2nm。

(4)大溝和小溝（二）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)——1953年，Watson

和Crick

提出。3.雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素（1）氫鍵（太弱）；（2）堿基堆積力（basestackingforce，由芳香族堿基π電子間的相互作用引起的，能形成疏水核心，是穩(wěn)定DNA最重要的因素；（3）離子鍵（減少雙鏈間的靜電斥力）。4.DNA雙螺旋的構(gòu)象類型B-DNA：92%相對濕度，鈉鹽；接近細(xì)胞內(nèi)的DNA構(gòu)象，與Watson和Crick提出的模型相似。5.堿基在一條鏈上的排列順序不受限制，但一旦確定后，即可決定另一條互補鏈上的序列。C-DNA：44~46%相對濕度?？赡苁翘囟l件下B-DNA和A-DNA的轉(zhuǎn)化中間物。D-DNA：60%相對濕度。E-DNA（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)線形分子、雙鏈環(huán)狀(dcDNA)超螺旋、染色體包裝A-DNA：75%相對濕度，與溶液中DNA-RNA雜交分子的構(gòu)象相似。Z-DNA：主鏈呈鋸齒型左向盤繞。B-DNA與Z-DNA的相互轉(zhuǎn)換可能和基因的調(diào)控有關(guān)。p489再次扭曲、螺旋（四）染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型多級螺旋模型壓縮倍數(shù)76405（8400）

DNA→核小體→螺線管→超螺線管→染色單體

2nm10nm30nm400nm2~10μm

一級包裝二級包裝三級包裝四級包裝

四、DNA與基因組織DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是指具有遺傳效應(yīng)的DNA片段或RNA，它能編碼蛋白質(zhì)或功能RNA。某些病毒的基因組是RNA。結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因基因組（一）DNA與基因（二）原核生物基因組的特點1.DNA大部分為結(jié)構(gòu)基因，每個基因出現(xiàn)頻率低。2.功能相關(guān)基因串聯(lián)在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA中（多順反子）。3.有基因重疊現(xiàn)象。ABCDEFG（三）真核生物基因組的特點1.重復(fù)序列單拷貝序列：在整個DNA中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。中度重復(fù)序列：在DNA中可重復(fù)幾十次到幾千次。高度重復(fù)序列：可重復(fù)幾百萬次高度重復(fù)序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度離心時在離心管中形成的區(qū)帶比主體DNA更靠近管口；富含G-C的更靠近管底，稱為衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）富含A-T富含G-C主體DNA2.有斷裂基因mRNA1872bp內(nèi)含子（intron)：基因中不為多肽編碼，不在mRNA中出現(xiàn)。ABCDEG7700bpF外顯子（exons）：為多肽編碼的基因片段。：由于基因中內(nèi)含子的存在。例外：組蛋白基因(histongene)和干擾素基因(interferongene)沒有內(nèi)含子。transcription四、RNA的結(jié)構(gòu)與功能——RNA分子高級結(jié)構(gòu)是含短的不完全的螺旋區(qū)的多核苷酸鏈。（一）tRNAtRNA約占RNA總量的15%，主要作用是轉(zhuǎn)運氨基酸用于合成蛋白質(zhì)。tRNA分子量為4S，1965年Holley測定酵母tRNAAla一級結(jié)構(gòu)，提出三葉草二級結(jié)構(gòu)模型。倒L型三級結(jié)構(gòu)主要特征：1.四臂四環(huán)；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有結(jié)構(gòu)；3.D環(huán)上有二氫尿嘧啶（D）；4.反密碼環(huán)上的反密碼子與mRNA相互作用；5.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動；6.TψC環(huán)含有T和ψ；7.含有修飾堿基和不變核苷酸。RNA二級結(jié)構(gòu)的通式：發(fā)夾結(jié)構(gòu)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)（二）rRNA占細(xì)胞RNA總量的80%，與蛋白質(zhì)（40%）共同組成核糖體。原核生物

真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S

90年代初，Noller證明23SrRNA具肽酰轉(zhuǎn)移酶活性，蛋白質(zhì)只是維持rRNA的構(gòu)象。（三）mRNA與hnRNAmRNA約占細(xì)胞RNA總量的3~5%，是蛋白質(zhì)合成的模板。真核生物mRNA的前體在核內(nèi)合成，包括整個基因的內(nèi)含子和外顯子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，形成分子大小極不均勻的hnRNA。真核生物mRNA特點：5’端有帽子結(jié)構(gòu)；3’端加polyA尾（四）snRNA和asRNAsnRNA主要存于細(xì)胞核中，占細(xì)胞RNA總量的0.1~1%，與蛋白質(zhì)以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、細(xì)胞分裂和分化、協(xié)助細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸、構(gòu)成染色質(zhì)等方面有重要作用。asRNA可通過互補序列與特定的mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，還可抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。五、核酸的性質(zhì)p503（一）一般理化性質(zhì)1.為兩性電解質(zhì)，通常表現(xiàn)為酸性。2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末3.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。5.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。6.利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應(yīng)鑒定DNA與RNA。（二）核酸的紫外吸收性質(zhì)p507核酸的堿基具有共扼雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm）。4.都溶于水不溶于有機溶劑如乙醇。——分離核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，當(dāng)核酸變性或降解時光吸收值顯著增加（增色效應(yīng)），但核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平（減色效應(yīng)）。

當(dāng)A＝1時，DNA：50ug/ml，

RNA和單鏈DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。

純DNA，A260/A280>=1.8<2.0

純RNA，A260/A280>=2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。

<2.0

，>1.8，DNA很純；>=2RNA很純用A260/A280還可來表示核酸的純度：核酸含量測定（三）核酸的變性：雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈，并不涉及共價鍵的斷裂。DNA變性是個突變過程。將紫外吸收的增加量達(dá)到最大增量一半時的溫度稱熔解溫度(meltingtemperature,Tm)。TmTmDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度

熱變性因素酸堿變性（pH小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）變性后粘度降低，紫外吸收增加。二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。

影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量

（G+C）%=（Tm—69.3）×2.44（2）介質(zhì)離子強度低，Tm低。（3）DNA均一性

均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍（五）核酸的復(fù)性（退火）：變性核酸的兩條互補鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過程。影響復(fù)性速度的因素：（1）單鏈片段濃度（2）單鏈片段的大?。?）溶液離子強度的大?。ㄔ礁咴饺菀祝?）溶液溫度的高低復(fù)性速度可用Co·t1/2

衡量（六）分子雜交p510：在退火條件下，不同來源的DNA互補形成雙鏈，或DNA單鏈和RNA鏈的互補形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程。探針：一段與待測DNA或RNA互補的核苷酸序列，用放射性同位素或熒光等標(biāo)記。原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細(xì)胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。Northern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。六、核酸的序列測定p518目前多采用Sanger的酶法和Maxam-Gilbert的化學(xué)法OHOH2CHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤ddATPPPP原理：基本反應(yīng)也是利用DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。反應(yīng)體系包括模板DNA、引物、4種核苷酸和DNA聚合酶外，還加入一定比例的ddNTP，它隨機的摻入合成的DNA鏈，一旦摻入DNA合成終止，得到以ddNTP為結(jié)尾的不同大小片段。通過電泳直接讀出DNA序列。小溝大溝主要特征：1.四臂四環(huán)；2.氨基酸臂3′端CCAOH的共有結(jié)構(gòu)；3.D環(huán)上有二氫尿嘧啶（D）；4.反密碼環(huán)上的反密碼子與mRNA相互作用；5.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動；6.TψC環(huán)含有T和ψ；7.含有修飾堿基和不變核苷酸?！狢CGGTAGCAATT——3′5′模板引物——GG—5′3′GGCGGCCGGCCATCCddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAddATPAGGCCATCGGGCCATCGTTGGddGTPGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTTddTTPCCATCGTTGA5′3′1989年，第一種基因藥物—重組αlb干擾素獲準(zhǔn)投放市場。至1999年，我國已有18種基因藥物和疫苗獲準(zhǔn)進行商業(yè)化生產(chǎn)，另有26種基因藥物處于臨床前或臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗，生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模。

1990年我國研制了第一例轉(zhuǎn)基因家畜，1991年山羊克隆獲得成功。

1993年我國第一例轉(zhuǎn)基因作物抗病毒煙草進入了大田試驗。

1997年第一例轉(zhuǎn)基因耐儲存番茄獲準(zhǔn)進行商品化生產(chǎn)，至1999年共有6種轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品投放市場。2000年我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花種植面積超過550萬畝。我國是人類基因組計劃國際大協(xié)作的成員國，承擔(dān)完成1%的任務(wù)。美、英、日、法、德、中科學(xué)家于2000年6月26日宣布人類基因組全部DNA序列的工作框架圖已經(jīng)完成。我國在國際上首先發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性耳聾的基因，基因治療已有4個項目進入臨床試驗階段。

生物芯片技術(shù)的開發(fā)研究與產(chǎn)業(yè)化正在與國際同步發(fā)展。染色體多級螺旋模型核酸水解p502酸水解：糖苷鍵比磷酸酯鍵易水解，嘌呤比嘧啶糖苷鍵易斷裂。（最易是DNA的嘌呤糖苷鍵）堿水解：RNA易被堿水解（室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物）；DNA耐堿

酶水解

生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶

RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外切酶——從末端逐個切下核苷酸核酸內(nèi)切酶：專一性水解某一特定核甘酸所形成的磷酸二酯鍵

最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶水解某一特定堿基序列

回文結(jié)構(gòu)核酸含量測定p514-516一）紫外吸收法二）定磷法：9.5%三）定糖法：地衣酚

二苯胺

核酸純度測定——最簡單方法：紫外吸收法DNA的凝膠電泳——按分子大小來分離溴化乙錠EB熒光染色

DNA的分離p513DNP——溶于濃鹽溶液1NNaCl，，但不溶于稀鹽溶液0.14NNaCl濃鹽溶液提取稀鹽溶液沉淀苯酚抽提乙醇沉淀RNP——溶于稀鹽溶液0.14NNaClRNase到處存在抽提要加酸性胍鹽/苯酚/氯仿/RNase抑制劑/高溫（器皿）SouthernBlotting