煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握無(wú)菌操作方法，熟悉煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立的整個(gè)過(guò)程。2.學(xué)習(xí)再生體系的建立方法，為掌握其他植物的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)；同時(shí)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供一個(gè)平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)十煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立

再生體系的建立主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：

1、用于驗(yàn)證植物細(xì)胞的全能性。

2、是植物基因工程的重要基礎(chǔ)，外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，受體細(xì)胞通過(guò)脫分化形成愈傷組織，愈傷組織通過(guò)再分化形成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。

3、也是植物快繁的一種方式，通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織再分化，能夠在短時(shí)間內(nèi)形成大量的不定芽或胚狀體，從而獲得大量的植株。實(shí)驗(yàn)原理

分化了的植物葉片細(xì)胞往往具有全能性，因此將煙草葉片從植株上分離后，給予一定的培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)葉片細(xì)胞脫分化，脫分化的細(xì)胞不斷分裂就形成愈傷組織，愈傷組織再在合適的培養(yǎng)條件下又能夠再分化形成完整植株，煙草愈傷組織的再分化是以不定芽的方式，即愈傷組織先形成不定芽，再由不定芽形成完整植株，從而完成了再生體系的建立。實(shí)驗(yàn)步驟一）材料的消毒：1）剪取生長(zhǎng)健壯的葉片，最好帶有葉柄。2）將整個(gè)葉片（包括葉柄）全部浸入70％的乙醇中，不斷振蕩30s。3）將乙醇倒掉，迅速加入0.1％的升汞，再將整個(gè)葉片（包括葉柄）全部浸入0.1％的升汞中，不斷振蕩10min。4）于工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子將上述葉片夾入無(wú)菌燒杯中，同時(shí)將升汞倒入盛有硫化鈉的桶里。5）用無(wú)菌水沖洗上述葉片3－5遍，取出后用無(wú)菌濾紙吸干，備用。二）接種：在無(wú)菌的條件下，取煙草無(wú)菌苗的葉片（或上述消過(guò)毒的葉片），剪成（0.5～1cm）*(0.5～1cm)大小的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中誘導(dǎo)愈傷組織，在此培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。三）不定芽生根：將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到1/2MS培養(yǎng)基中，其目的是誘導(dǎo)不定芽生根，使其發(fā)育成煙草小植株。

接種第一天

接種第二天，因?yàn)橥庵搀w細(xì)胞開(kāi)始被誘導(dǎo)脫分化，并不斷分裂增殖，造成葉片中央與邊緣的細(xì)胞分裂不均勻，因此，葉片中央凸起。接種第五天，脫分化細(xì)胞不斷分裂增殖，形成愈傷組織，表現(xiàn)為葉片邊緣泛黃增厚，葉片中央進(jìn)一步凸起。接種第九天，脫分化細(xì)胞不斷增值，愈傷組織不斷增厚，整個(gè)葉片都翹起，并且已經(jīng)開(kāi)始再分化形成綠色生長(zhǎng)點(diǎn)。第九天（誘導(dǎo)生成愈傷組織）

接種第十九天，綠色生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)一步發(fā)育形成了不定芽，不定芽長(zhǎng)度最長(zhǎng)可達(dá)1cm。第十