高效液相 色譜 基本原理

第二章化學(xué)品的分離主講：張中一青島大學(xué)-化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院(環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院)Telmail:Zhangzy@Part.2高效液相、氣相色譜2.3高效液相色譜法高效液相色譜：在液相色譜柱中，采用顆粒極細(xì)的高效固定相，采用高壓輸液泵輸送流動相，全部工作過程通過儀器控制完成。高效液相色譜法優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。尤其適用于那些不宜用氣相色譜分析的難揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性物質(zhì)、離子型物質(zhì)和生物大分子等。目前已知化合物中，80%的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析。

色譜圖檢測信號和時間的關(guān)系圖不同的色譜峰對應(yīng)相應(yīng)的組分可以得到相應(yīng)組分的保留時間和峰面積信息。保留時間–定性分析峰面積–定量分析色譜峰的相關(guān)基本術(shù)語保留值：保留時間(tR):試樣組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)最高峰時多需要的時間。

死時間（to）:不被保留物質(zhì)從進(jìn)樣到出峰最大值的時間。

調(diào)整保留時間(tR′

)：tR′=tR-to容量因子κ′：等于（固定相中溶質(zhì)的量/移動相中溶質(zhì)的量）相對保留值α：表示相鄰兩峰調(diào)整保留時間的比值。理論塔板數(shù)N：對于色譜峰柱效率的一種度量。分離度Rs：色譜柱總分離效率的指標(biāo)，代表了兩組峰的分離效果。峰高（PeakHeigh)：從峰最大值到峰底的距離峰面積（PeakArea)：峰與峰底之間的面積峰面積=半峰寬*出峰高度(A=h*W)Wh兩個相鄰峰的分離程度。以兩個組份保留值之差與其平均半峰寬值的比來表示：當(dāng)R<1時，兩峰會有部分重疊當(dāng)R=1時，兩峰少有重疊（5％的重疊）當(dāng)R>1.5時，兩峰完全分離（分離程度為大于99.7%）分離度（Resolution)提高分離度的途徑1）增加N：增加柱長，提高填充劑效能。N增加峰型變窄。2）增加α：改變固定相、流動相極性或用梯度洗脫，延長分離時間。3）改變κ′：移動相極性減小則κ′增加，流出時間增加，峰型變寬分離度提高。HPLC的儀器構(gòu)成高效液相色譜儀一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。①高壓輸液泵高壓輸液泵要求能提供連續(xù)無脈沖的液流。泵所供應(yīng)的恒定流量變動不宜超過1%，流量范圍在0.1-10mL/min，泵壓一般在10-40MPa。商品泵主要包括：螺旋注射泵、氣動放大泵、往復(fù)柱塞泵等。高效液相色譜柱是決定分離效率的核心部分。一般采用不銹鋼材料制成。色譜柱內(nèi)壁應(yīng)經(jīng)過精密加工，具有高的光滑度。兩端接頭采用不銹鋼或聚四氟乙烯密封圈。常用色譜柱的內(nèi)徑在2-6mm，長度在10-50cm。色譜柱中緊密填充粒度為5-10微米的顆粒狀固定相。最常用柱子是C-18柱（ODS柱）②色譜柱高效液相色譜可分為分析型和制備型兩種。分析型色譜柱常用內(nèi)徑為1~6mm的管子，而制備柱則用較粗的管子，一般用內(nèi)徑為25mm的管子，有的可達(dá)60mm。柱子長度從幾十厘米到幾米，一般為25cm到1m。③檢測系統(tǒng)高效液相色譜常用的商品檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、光散射檢測器和電化學(xué)檢測器等。檢測器性能紫外-可見檢測器示差折光檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器應(yīng)用范圍測量參數(shù)線性范圍檢測限/g.ml-1能否用于梯度洗脫對流速的敏感性對溫度的敏感性選擇性吸光度2.410410-9能不敏感低通用性折射率10410-10不能不敏感敏感選擇性熒光強(qiáng)度10310-10能不敏感低選擇性電流10410-10不能敏感敏感紫外-可見檢測器：是高效液相色譜中最廣泛應(yīng)用的檢測器，適用于那些能在紫外/可見區(qū)有吸收的物質(zhì)。傳統(tǒng)的紫外-可見檢測器一般選擇在最大吸收波長處進(jìn)行檢測。近年來發(fā)展起來的二極管陣列檢測器可以實時記錄各個波長下的吸光度，可以給出每個色譜峰的保留時間-吸光度-吸收波長的三維譜圖。熒光檢測器：適用于檢測紫外光激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。其靈敏度比紫外-可見檢測器高2-3個數(shù)量級，可檢測出ng級痕量有機(jī)物。具有極高的靈敏度和良好的選擇性。示差折光檢測器：對一些紫外沒有吸收的樣品可以用示差折光檢測器，它是通過檢測溶液折光指數(shù)的變化來測定樣品濃度的。它是一種通用檢測器。但是其靈敏度比紫外-可見檢測器低3個數(shù)量級，受溫度影響波動大，不適用于梯度淋洗。流動相的選擇1）正相色譜與反相色譜2）分離方式的選擇分子量大于2000以上的大分子和高分子可采用凝膠色譜；極性大的水溶性化合物，在水中可以解離的離子化合物可采用不同類型的離子交換樹脂作為填料；在水中溶解但不電離的化合物，如糖類、可以用反相色譜，以甲醇或乙腈-水為流動相；醇水不溶的弱極性和非極性樣品主要用正相吸附色譜法，以全多孔硅膠或氰基鍵合硅膠為固定相。氣相色譜法基本原理氣相色譜法(gaschromatography，GC)是采用氣體作為流動相的一種色譜法，具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速分離的特點(diǎn)。在氣相色譜中，流動相(稱為載氣)不和組分分子相互作用，其功能僅僅是攜帶試樣。氣固色譜-固定相是具有多孔性及大表面積的吸附劑微粒。氣液色譜-固定相是載體表面涂一層高沸點(diǎn)有機(jī)化合物的液膜(稱為固定液)。GC系統(tǒng)概論氣相色譜高效液相色譜只能分析約20%揮發(fā)性物質(zhì)幾乎可分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)使用毛細(xì)管柱可得到很高的柱效色譜柱不能很長，柱效相對較低有很靈敏的檢測器

(ECD)和較靈敏的通用型檢測器

(FID&TCD)無靈敏的通用型檢測器流動相為氣體無毒，較易處理流動相毒性、費(fèi)用較高運(yùn)行操作容易運(yùn)行操作比氣相難GC的基本原理進(jìn)樣時分離時洗脫時應(yīng)用領(lǐng)域基礎(chǔ)化學(xué)塑膠農(nóng)藥殺蟲劑添加劑石化工業(yè)原油分析模擬蒸餾油品分析天然氣分析汽油添加劑分析環(huán)境檢測空氣污染水污染固體廢棄物土壤分析食品分析食物飲料香精香料農(nóng)殘制藥/刑偵新藥開發(fā)品質(zhì)管制有機(jī)溶劑殘留藥物濫用2.氣相色譜系統(tǒng)控制面板氣路控制壓力控制柱箱計算機(jī)色譜工作站檢測器進(jìn)樣口氣體鋼瓶1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化器；4-氣流調(diào)節(jié)閥；5-轉(zhuǎn)子流量計；6-氣化室；7-色譜柱；8-檢測器①氣路系統(tǒng)氣路系統(tǒng)是一個密閉的管路系統(tǒng)，載氣在其中穩(wěn)定連續(xù)地運(yùn)行，要控制好載氣的純度和載氣流速。它包括載氣源、凈化干燥器、減壓閥、穩(wěn)壓閥、穩(wěn)流閥、壓力表、流量計、各種管線等。常見的氣相色譜儀有單柱單氣路和雙柱雙氣路兩種類型，當(dāng)前一般氣相色譜儀都是雙柱雙氣路的，這種氣路結(jié)構(gòu)的儀器既能用于恒溫分析，也適用于程序升溫分析。②進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室組成。氣化室的作用是將液體樣品瞬間氣化，但又不發(fā)生分解。要把氣體或液體樣品快速而定量地加到色譜柱上端。③分離系統(tǒng)(色譜柱)色譜柱是氣相色譜的心臟，樣品的分離就是在柱內(nèi)進(jìn)行的。色譜柱由柱管和其中的固定相組成。填充柱的內(nèi)徑約為2～6mm，長約1—6m，用不銹鋼、銅、玻璃或聚四氟乙烯等材料制成，管內(nèi)裝填顆粒狀的固定相。色譜柱的外形有螺旋形和u型兩種，色譜柱被安裝在密閉隔熱的柱箱內(nèi)，以利于準(zhǔn)確控制柱溫。柱內(nèi)固定相是分離的關(guān)鍵。④檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)由檢測器及其控制裝置組成，其作用是將被色譜柱分開的各個組分的濃度或質(zhì)量信號轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號，并輸送給放大記錄系統(tǒng)。檢測器的溫度對靈敏度等有一定影響，故也應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制。檢測器是色譜儀中的一個關(guān)鍵部件。常用的檢測器有熱導(dǎo)池檢測器、氫火焰離子化檢測器、電子捕獲檢測器和火焰光度檢測器等類型。⑤記錄系統(tǒng)該系統(tǒng)包括放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置等。由于檢測器產(chǎn)生的電信號十分微弱，所以必須用放大器放大，再由記錄儀記錄下代表各組分的色譜圖，供定性定量分析用。采用氣相色譜與微機(jī)聯(lián)機(jī)的儀器，操作人員可直接使用按色譜術(shù)語設(shè)計的鍵盤，來完成各種功能的色譜操作和數(shù)據(jù)的處理，并將結(jié)果直接打印出來，快速準(zhǔn)確。⑥溫度控制系統(tǒng)溫度是氣相色譜分析中的最重要最敏感的工作條件之一，要求對氣化室、檢測器和色譜柱分別進(jìn)行嚴(yán)格的溫度控制，控溫精度均為±0.1℃。儀器上有3套獨(dú)立的自動溫度控制電路及其輔助設(shè)備，分別使氣化室、檢測器恒定在適當(dāng)溫度，使柱溫恒定或按程序升溫。溫度控制系統(tǒng)的主要元件有鉑電阻或熱電偶等熱敏元件，電子放大器、可控硅、電熱器等，柱箱中還有排風(fēng)扇。通常用溫度計和測溫毫伏計來顯示溫度的高低。氣體作用：1）載氣：作為色譜的流動相2）檢測器的工作氣體。載氣：惰性：He,Ar,N2,H2.根據(jù)檢測器,價格及方便程度來決定采用壓力調(diào)節(jié)器以獲得恒定的儀器輸入壓力控制流量來得到恒定的流速氣體的類型由檢測器決定.氣體要求色譜級的高純氣體99.999%

過濾系統(tǒng):

除氧.

活性炭除碳?xì)浠衔铩７肿雍Y除水氣體的供應(yīng)和控制載氣推薦采用H2、He:分離度好對TCD靈敏度最高，而且可保護(hù)W絲注意安全問題5.進(jìn)樣口作用：樣品進(jìn)樣和汽化.要求：精度和重現(xiàn)性根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇進(jìn)樣技術(shù)圖4-11旋轉(zhuǎn)式六通閥(a)取樣位置；(b)進(jìn)樣位置色譜柱色譜柱材料和結(jié)構(gòu)

填充柱-短(2-3米),管內(nèi)徑較粗.

毛細(xì)管柱-長(>60米),內(nèi)徑較細(xì).

所有材料均要求化學(xué)及熱性質(zhì)穩(wěn)定.

熱穩(wěn)定性-分析時所使用的溫度不應(yīng)致使色譜柱材質(zhì)受到破壞

化學(xué)穩(wěn)定性-在一定溫度下，色譜柱材質(zhì)不受分析物的影響注意：用色譜級、干凈的材料。填充柱玻璃、特氟瓏及不銹鋼材質(zhì)(惰性).填充柱中填有固態(tài)載體，上面涂有液態(tài)固定相，用于氣液色譜（GLC）或直接填充多孔固體，用于氣固色譜（GSC）.填充柱尺寸固態(tài)載體是液態(tài)固定相附著的載體增加與樣品接觸的表面積。細(xì)小、均勻、多孔。大部分采用硅土.標(biāo)準(zhǔn)大小顆粒.直徑大小與目數(shù)的關(guān)系例如:80/100目表明所有的顆粒將通過80目篩但不通過100目篩.80目篩是指篩網(wǎng)每英寸有80根標(biāo)準(zhǔn)直徑的網(wǎng)線。7.檢測器通用型檢測器（UniversalDetector)熱導(dǎo)檢測器（TCD）氫火焰檢測器（FID）

選擇性檢測器電子捕獲（ECD）脈沖火焰光度檢測器（PFPD）氮磷檢測器（TSD)氣、液相色譜的定量分析色譜的定量分析色譜相當(dāng)重要的應(yīng)用決定組分質(zhì)量、濃度或物質(zhì)在樣品中占的百分比平均或標(biāo)準(zhǔn)偏差用來作分析精密度的表示定量結(jié)果的數(shù)種計算方式出峰高度分析(peakhigh)出峰面積分析(peakarea)外標(biāo)法(externalstandard)內(nèi)標(biāo)法(internalstandard)百分歸一法(normalizedpercent)出峰面積分析范例

校正因子校正因子是定量計算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位面積所代表的被測組分的量?？捎孟率奖硎荆?/p>

Mi–I組分的量；fi–I組分的校正因子；Ai–I組分的峰面積定量分析的依據(jù)是被測組分的量與響應(yīng)信號成正比，但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測器上產(chǎn)生的信號也不同，直接用響應(yīng)信號定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子。歸一化法將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計算其中某一組份百分含量的定量方法：其中：xi－試樣中組份I的百分含量

fi－組份I的校正因子

Ai－組份I的峰面積或峰高外標(biāo)法（ExternalStandard)在相同分析條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品的色譜峰面積或峰高1.用已知的標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣，測量各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應(yīng)信號與百分含量的關(guān)系曲線2.測量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出其對應(yīng)的百分含量。要求：進(jìn)樣量、色譜分析條件嚴(yán)格不變

外標(biāo)法利用一系列標(biāo)準(zhǔn)品建立校正曲線精確的標(biāo)準(zhǔn)品含量與進(jìn)樣量必須已知建立出峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品濃度的關(guān)系圖校正曲