第七章微生物遺傳變異與育種

第七章微生物的遺傳變異和育種（1）遺傳型（基因型）————某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因的總和

。（親代與子代相似）（3）表型（表現(xiàn)型）———某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和，具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。（2）變異———生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。（親代與子代、子代間不同個體不完全相同）

變異了的微生物與原來的微生物有所不同，稱為變種。遺傳變異的幾個基本概念（4）表型飾變————即外表的修飾性發(fā)生改變。是一種不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表形變化。特點：表型的差異只與環(huán)境有關(guān),暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為。如：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia

marcescens）。遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變。特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為。（自發(fā)突變頻率通常為10-6~10-9）遺傳學(xué)的模式生物——微生物的獨特生物學(xué)特性：（1） 個體的體制極其簡單；（2） 營養(yǎng)體一般都是單倍體；（3） 易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖；（4） 繁殖速度快；（5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物；（6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7） 環(huán)境條件對微生物群體中各個個體作用的直接性和均一性；（8） 易于形成營養(yǎng)缺陷型；（9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒；（10)存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式。第七章微生物的遺傳變異和育種第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)基因重組和雜交育種第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式三個經(jīng)典實驗證明核酸是微生物遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化實驗噬菌體感染實驗植物病毒的重建實驗遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸。這個結(jié)論的得出就是以微生物為研究對象而得來的。一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典實驗

（一）核酸存在的七個水平細胞水平細胞核水平染色體水平 核酸水平基因水平密碼子水平核苷酸水平二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式

1.細胞水平大部分DNA集中在細胞核或核區(qū)。不同微生物或同種微生物的不同細胞中細胞核數(shù)目常不同。2.細胞核水平真核與原核，被稱為核基因組、核染色體或基因組。多數(shù)存在核外DNA含量少、能自主復(fù)制的核外染色體——質(zhì)粒。3.染色體水平（1）染色體數(shù)：不同生物染色體數(shù)目差別很大。（2）染色體倍數(shù)自然界中微生物染色體多為（n），只有少數(shù)營養(yǎng)細胞及合子為（2n）原核生物通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合可形成不穩(wěn)定的部分（2n）。4.核酸水平（1）核酸種類（2）核酸結(jié)構(gòu)（3）DNA長度即基因組的大小，可用bp、kb、mb表示。不同微生物基因組大小差別很大。5.基因水平原核生物的基因組成以下調(diào)控系統(tǒng)而發(fā)揮作用：

啟動基因（啟動子）

操縱子操縱基因基因調(diào)控系統(tǒng)

結(jié)構(gòu)基因

調(diào)節(jié)基因6.密碼子水平遺傳密碼就是指DNA鏈上各個核苷酸的特定排列順序。7.核苷酸水平AMP、TMP、GMP、CMP，E.coli的T偶數(shù)噬菌體的DNA中有5—羥甲基胞嘧啶。（二）原核生物的質(zhì)粒質(zhì)粒電鏡照片

凡游離于原核生物基因組外，具有獨立復(fù)制能力的小型共價閉合環(huán)狀的

dsDNA分子，稱為質(zhì)粒。1、質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb（細菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）。2、質(zhì)粒的特征（1）形狀大?。撼菪Y(jié)構(gòu)、106~108Da、1%核基因組大小。

（2）數(shù)量：每個菌體內(nèi)有一個或幾個、或很多。（3）質(zhì)粒上攜帶有某些核基因組上所沒有的基因，使原核生物的生長繁殖過程中增添了一些特殊功能，如：接合、產(chǎn)毒、抗藥、固氮、產(chǎn)特殊酶、降解毒物等。（4）是一種獨立存在于細胞內(nèi)的復(fù)制子。嚴緊型復(fù)制控制：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制同步。松弛型復(fù)制控制：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制不同步。2、質(zhì)粒的特征（5）少數(shù)質(zhì)?？稍诓煌觊g轉(zhuǎn)移，如：F因子、R因子。（6）質(zhì)粒消除：因某些理化因素的影響致使質(zhì)粒復(fù)制受抑而核染色體的復(fù)制仍繼續(xù)進行，從而引起子代細胞中不帶質(zhì)粒的現(xiàn)象。（7）有些質(zhì)粒具有與核染色體整合和脫離的功能——附加體。（8）質(zhì)粒還有重組的功能：可在質(zhì)粒與質(zhì)粒間、質(zhì)粒與核染色體間發(fā)生基因重組。可用作基因工程的載體。3、質(zhì)粒的種類（質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)）（1）F因子（fertilityfactor致育因子、性因子）是E.coli等細菌決定性別并有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。

（2）R因子（resistancefactor）又稱R質(zhì)粒存在于某些腸道細菌中的抗藥性質(zhì)粒，這些細菌不僅能抗多種抗生素等藥物，抗重金屬等離子（汞、鎘、鎳、鈷、鋅、砷），還能把抗藥基因傳遞到其他腸道細菌中。（3）Col因子（colicinogenicfactor大腸桿菌素質(zhì)粒、大腸桿菌素因子）使E.coli等細菌產(chǎn)生大腸桿菌素等細菌素，具有通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等方式專一地抑制或殺死其他腸道細菌生長。4、幾種典型質(zhì)粒

（5）Ri質(zhì)粒發(fā)根土壤桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌中，可侵染雙子葉植物的根部，并誘生大量毛狀的不定根。（7）降解性質(zhì)粒（代謝質(zhì)粒）假單胞菌中發(fā)現(xiàn)，可為降解一系列復(fù)雜有機物的酶編碼。在污水處理、環(huán)境保護等方面有特有作用。（6）巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）根瘤菌中，其上有一系列與固氮相關(guān)的基因。（4）Ti質(zhì)粒即誘癌質(zhì)粒存在于根癌桿菌中，可引起許多雙子葉植物根癌。第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變二、突變與育種一、基因突變（突變）

是變異的一類。凡指細胞內(nèi)或病毒粒內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)突然發(fā)生的可遺傳的變化?？勺园l(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。狹義的突變：專指基因突變（點突變）。廣義的突變：包括基因突變和染色體突變。突變的幾率：很低——10-6-10-9。野生型菌株（wildtypestrain，野生型）：從自然界分離到的、沒有發(fā)生過突變的菌株。突變株（mutant，突變體、突變型）：野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株。

條件致死突變型（株）（一）突變類型

突變株的表型選擇性突變株非選擇性突變株營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）突變的類型很多，按突變后極少數(shù)突變株的表型能否在選擇培養(yǎng)基上迅速選出和鑒別，可分為：1.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）

某一野生菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法在基本培養(yǎng)基（minimummedium，MM）上正常生長繁殖的變異類型。2.抗性突變型（resistantmutant）

野生菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對某化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性變異類型。3.條件致死突變型（conditionallethalmutant）

某菌株經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變類型。如：溫度敏感突變株（Ts突變株）。4.形態(tài)突變型（morphologicalmutant）

由基因突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異類型。5.抗原突變型（antigenicmutant）

由基因突變引起的細胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的變異類型。。6.產(chǎn)量突變型（metabolitequantitativemutant）

因基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。若產(chǎn)量明顯高于原始菌株者，稱為正突變；反之稱負突變。（二）基因突變的特點1.自發(fā)性：可自發(fā)地發(fā)生突變。2.不對應(yīng)性：突變性狀與引起的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系。3.稀有性：通常自發(fā)突變的頻率在10-6-10-9間。4.獨立性：某基因的突變率不受他種基因突變率的影響。5.可誘變性：自發(fā)突變的頻率可因誘變劑的影響而大為提高（10-105倍）。6.穩(wěn)定性：基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的。7.可逆性：野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變，也可發(fā)生相反的回復(fù)突變。（三）基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明變量試驗

涂布試驗

影印培養(yǎng)試驗

大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物10ml10ml(培養(yǎng)前先分成50小管)(在同一個大管中作整體培養(yǎng))

3714435

抗噬菌體菌落數(shù)抗噬菌體菌落數(shù)變量試驗

甲管乙管噬菌體起淘汰原始未突變株和鑒別抗噬菌體突變株的作用。（10mL）（10mL）涂布試驗

涂布敏感菌5×104個共12個平板5×104個菌落5000個細菌/菌落噴入T1保溫重新涂布后噴入T1保溫6個平板共353個菌落

6個平板共28個菌落噬菌體的加入只起鑒別抗噬菌體的自發(fā)突變是否發(fā)生。E.coli影印培養(yǎng)無藥培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基影印培養(yǎng)試驗

原始敏感菌種證明微生物的抗藥性突變是在接觸藥物前自發(fā)產(chǎn)生的，且這一突變與相應(yīng)的藥物毫不相干。E.coli基因突變：一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變?；蛲蛔兪侵匾纳飳W(xué)現(xiàn)象，它是一切生物變化的根源，連同基因轉(zhuǎn)移、重組一起提供了推動生物進化的遺傳多變性。突變自發(fā)突變誘變環(huán)境因素的影響，DNA復(fù)制過程的偶然錯誤等而導(dǎo)致，一般頻率較低，通常為10-6-10-9。某些物理、化學(xué)因素對生物體的DNA進行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。（四）基因突變及其機制基因突變的機制是多樣性的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的。1、誘發(fā)突變（誘變）指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。誘變劑：凡具有誘變效應(yīng)的任何因素。誘變劑的種類很多，有物理因素（UV、激光、離子束、X射線、γ射線、快中子）和化學(xué)因素（亞硝酸、氮芥、烷化劑、堿基類似物、吖啶類化合物）。

誘變機制

（五）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)

已知的DNA損傷類型很多，機體對其修復(fù)方法各異。1.紫外線對DNA的損傷DNA中嘧啶對UV的敏感性較強，經(jīng)UV照射后相鄰嘧啶會形成嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物。形成二聚體后，造成局部DNA分子無法配對，從而引起微生物的死亡或突變。2.微生物修復(fù)受損DNA的作用

（1）光復(fù)活作用把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。對照：8×106個/mlE.coli100個/mlE.coli實驗：8×106個/mlE.coli

2×106個/mlE.coli

UVUV360~490nm可見光，30min光復(fù)活作用機制：

經(jīng)UV照射后帶有嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶（光解酶、光裂合酶）結(jié)合。這種復(fù)合物在300~500nm可見光下時，此酶會因獲得光能而激活，并使二聚體分解成單體。同時光解酶也會從復(fù)合物中釋放出來，以便從新執(zhí)行功能。（2）切除修復(fù)（暗修復(fù)）

是活細胞內(nèi)一種不依賴可見光就可對被紫外線等誘變劑損傷后的DNA進行修復(fù)的方式。作用機制：通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸。在整個修復(fù)過程中，共有四種酶參與。二、突變與育種自發(fā)突變與育種從生產(chǎn)中選育定向培育優(yōu)良品種誘變育種

誘變育種的原則誘變育種的基本環(huán)節(jié)（一）自發(fā)突變與育種

1.

從生產(chǎn)中育種生產(chǎn)中，自發(fā)突變的微生物中有可能出現(xiàn)一定幾率的正突變。2.

定向培育優(yōu)良菌株是一種利用微生物的自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，不斷地移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。

如：炭疽芽孢桿菌活菌苗、卡介苗的選育。缺點：費時費力、工作被動、效果很難預(yù)測。（二）誘變育種

利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速高效的篩選方法從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)實驗和生產(chǎn)實踐用。方法簡便易行、條件和設(shè)備要求簡單。誘變育種具有極其重要的實踐意義。在當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)或其他大規(guī)模的生產(chǎn)實踐中，大部分菌種為誘變而產(chǎn)生的變異菌株。

效價：指有效成分的濃度。1ug/ml稱為1單位1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(U·ml－1)100250500～850～850～8000～2萬～5萬

5萬～10萬

從青霉素產(chǎn)量看誘變育種1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)出發(fā)菌株計算出誘變2、誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株選擇簡便有效的誘變劑處理單細胞或單孢子懸液選用最適劑量的誘變劑設(shè)計或采用高效篩選方案或方法充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標誘變劑的種類很多，有物理因素和化學(xué)因素兩類。擬輻射物質(zhì)：除了能誘發(fā)點突變，還能誘發(fā)一般只有輻射才能引起的染色體畸變這類DNA的大損傷的物質(zhì)。如：氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等。在選用理化因素作誘變劑時

，在同樣效果下，應(yīng)選用最簡便的因素；而在同樣簡便的條件下，應(yīng)選用最高效的因素。（1）選擇簡便有效的誘變劑出發(fā)菌株菌體的稀釋液接種培養(yǎng)接種分離紫外線使用UV照射最為方便。取5ml單細胞懸液置于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，開蓋照射；時間不短于10~20s，也不長于10~20min。挑選優(yōu)良菌株15W、30cm5mL使用化學(xué)誘變劑的十分簡便的方法：①平板上涂布出發(fā)菌株②在其上分區(qū)并放置誘變劑顆?；蛘从姓T變劑溶液的小濾紙片③保溫培養(yǎng)④誘變劑周圍有一透明的制菌圈，在制菌圈的邊緣存在有若干突變株的菌落⑤一一制成菌懸液⑥分別涂布在瓊脂平板表面并保溫培養(yǎng)⑦長成大量單菌落⑧選出所需突變菌株。化學(xué)誘變劑的使用：化學(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是終止反應(yīng)的方法很多。出發(fā)菌株含誘變劑的液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種分離選擇優(yōu)良突變株艾姆斯試驗

原理：致癌物與誘變劑具有很高的相關(guān)性，能提高營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變率的可疑物是誘變劑，所以很可能是致癌物。

作用：測定潛在的化學(xué)致癌物。

主要材料：沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株（還應(yīng)是DNA修復(fù)酶的缺陷型）或大腸桿菌色氨酸缺陷型菌株S.t.his回變S.t.his

吸入濾紙片保溫可疑“三致”試樣

鼠肝勻漿（含羥化酶）陽性陰性

利用回變檢測致癌劑

——艾姆斯試驗法艾姆斯試驗法廣泛用于檢測食品、飲料、藥品、飲水和環(huán)境等試樣中的致癌物（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株生產(chǎn)中用過的自發(fā)變異菌株采用具有有利性狀的菌株采用已發(fā)生其他變異的菌株采用對誘變劑敏感性較高的增變菌株出發(fā)菌株即用于育種的原始菌株。選用合適的出發(fā)菌株有利于提高誘變效率。

（3）處理單細胞或單孢子懸液用于誘變育種的細胞應(yīng)盡量選用單核細孢放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子細菌指數(shù)期，芽孢菌應(yīng)處理芽胞出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸液使每個細胞均勻接觸誘變劑并防止長出不純菌落。（4）選用最適的誘變劑量劑量：以誘變劑濃度和處理時間來表示。合適劑量：能擴大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量。（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)兩種或多種誘變劑先后使用同種誘變劑重復(fù)使用兩種或多種誘變劑同時使用誘變劑的復(fù)合使用常表現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)，有利于育種。（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標淀粉酶變色圈試驗變色圈大的為淀粉酶高產(chǎn)菌落（7）設(shè)計或采用高效篩選方案或方法一個出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個單單孢子菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理3、三類突變株的篩選方法

高產(chǎn)突變菌株的篩選方法

抗藥性突變株的篩選方法

營養(yǎng)缺陷型的的篩選方法

誘變

春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液·春日霉素高產(chǎn)菌種瓊脂塊培養(yǎng)法篩選

（1）產(chǎn)量突變株的篩選含供試菌種（拮抗對象）的瓊脂平板

優(yōu)點：在此條件下，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴散到瓊脂塊外，因此測得的結(jié)果與搖瓶實驗結(jié)果十分相似，而工作效率卻大為提高。紅點為抑菌圈含異煙肼接敏感菌含突變株（2）抗藥性突變株的篩選方法——梯度培養(yǎng)皿法是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。用此法篩選抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)菌株。

利用梯度平板法篩選抗代謝類似物突變株，可達到定向培育的目的1）與營養(yǎng)缺陷突變株的篩選相關(guān)的幾個概念相關(guān)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

[-]完全培養(yǎng)基

[+]

補充培養(yǎng)基

[A]或[B]等

三類遺傳型野生型

[A+B+]營養(yǎng)缺陷型

[A+B-]原養(yǎng)型

[A+B+]（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選與營養(yǎng)要求有關(guān)的三類遺傳型2）營養(yǎng)缺陷型的篩選辦法誘變劑處理淘汰野生型檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印接種法鑒定缺陷型菌絲過濾法抗生素法①誘變劑處理：與一般誘變處理相同。

②淘汰野生型：在誘變后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例較低（百分之幾～千分之幾）。需選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ蕴瓰閿?shù)眾多的野生型菌株，達到“濃縮”極少數(shù)營養(yǎng)缺陷型的目的?？股胤ǎ呵嗝顾胤ǎㄟm用于細菌）、制霉菌素法（適用于真菌）等方法。菌絲過濾法：用濾孔較大的擦鏡紙過濾。適用于進行絲狀生長的真菌和放線菌。夾層培養(yǎng)法（同一培養(yǎng)皿）小菌落是第二次長起來的（營養(yǎng)缺陷型）③檢出營養(yǎng)缺陷型：具體方法很多。用含有特定生長因子的基本培養(yǎng)基作第四層可直接分離到相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型限量補充培養(yǎng)法（同一培養(yǎng)皿）

微量蛋白胨的完全培養(yǎng)基上小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株若想獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型突變株，只要在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)就可以達到。野生型細胞能迅速長成大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則因營養(yǎng)受限制生長緩慢。

逐個檢出法（兩個培養(yǎng)皿）涂布培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上不長菌落完全培養(yǎng)基上長出菌落含誘變劑的液體培養(yǎng)基菌種營養(yǎng)缺陷型影印接種法（兩個培養(yǎng)皿）④鑒定缺陷型：可生用長譜法進行鑒定。缺陷型菌株生長譜測定第三節(jié)基因重組和雜交育種基因重組（遺傳重組，重組）：兩個獨立基因組內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過程。重組是在核酸分子水平上的一個概念，而雜交是在細胞水平上進行的，但其中包含了核酸分子水平上的重組?；蛑亟M是雜交育種的理論基礎(chǔ)。微生物基因重組的形式較多。

一、原核生物的基因重組二、真核微生物的基因重組

一、原核生物的基因重組原核生物的基因重組形式很多：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合。其特點為：1.片段性，僅一小段DNA序列參與重組；2.單向性，即從供體菌向受體菌（或從供體基因向受體基因）作單方向轉(zhuǎn)移；3.轉(zhuǎn)移機制獨特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。

（一）轉(zhuǎn)化(transformation)

1．定義

受體菌（recipientcell,receptor）直接吸收供體菌（donorcell）的DNA片段并把它整合到自己的基因組中，而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子。（transformant）。2.轉(zhuǎn)化微生物的種類

種類十分普遍：原核生物，真核微生物。不需要噬菌體做媒介，不需要細胞間直接接觸的基因重組方式

1）感受態(tài)（competence）指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。在細菌的感受態(tài)出現(xiàn)時，具有從周圍環(huán)境吸收DNA分子而不被DNA酶破壞的生理特性。處于感受態(tài)的細胞，吸收DNA的能力有時可比一般細胞大1000倍。

3.轉(zhuǎn)化條件

（1）親緣關(guān)系：多同緣DNA。

（2）能進行轉(zhuǎn)化的細胞必須是感受態(tài)的。

2）與感受態(tài)的出現(xiàn)有關(guān)的因素受該菌遺傳性、菌令、生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件等影響。一般出現(xiàn)在生長的指數(shù)期后期，有的出現(xiàn)在指數(shù)期末和穩(wěn)定期；在具有感受態(tài)的微生物中，感受態(tài)細胞所占比例和維持時間也不同；外界環(huán)境因子如環(huán)腺苷酸（cAMP）及Ca2+

等對感受態(tài)也有重要影響（環(huán)腺苷酸可提高1000倍、Ca2+能促使細胞進入感受態(tài)）。3）感受態(tài)因子：是受體細胞表面上的調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白（胞外蛋白），能使轉(zhuǎn)化因子結(jié)合在受體細胞表面。包括3種主要成分，即：膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白（membrane-associatedDNAbindingprotein）,細胞壁自溶素（autolysin）和幾種核酸酶。不同微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同。

自然情況下可由細菌細胞自行裂解產(chǎn)生，實驗室里通過提取獲得。雙鏈ＤＮＡ有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒有。4.轉(zhuǎn)化因子（transformingprinciple）

來自供體菌的DNA片段或質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。通常為

15kb左右的片段，質(zhì)粒DNA也可。

每個受體細胞表面約有30~80個轉(zhuǎn)化因子結(jié)合點，當(dāng)轉(zhuǎn)化因子結(jié)合到受體表面結(jié)合點上時，DNA一條鏈被受體細胞膜上的核酸酶分解，另一條鏈進入受體細胞，通過整合與受體細胞進行基因重組，有人發(fā)現(xiàn)DNA也可通過雙鏈形式進入受體細胞形成雙倍體的轉(zhuǎn)化子。5、轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程被研究得較深入的是G+細菌肺炎鏈球菌（Streptococcus

pneumoniae）。

轉(zhuǎn)化過程6、轉(zhuǎn)化的特點

不需兩個細胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。6.轉(zhuǎn)染（transfection）指用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。作為轉(zhuǎn)染的病毒核酸，決不是作為供體基因的功能，被感染的宿主也決不是能形成轉(zhuǎn)化子的受體菌。轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類

通過缺陷噬菌體（defectivephage）的媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新性狀的重組細胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。作為媒介的缺陷噬菌體可分為：完全缺陷噬菌體、部分缺陷噬菌體。(二)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（通過完全缺陷噬菌體）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（通過部分缺陷噬菌體）需要噬菌體做媒介，不需要細胞間直接接觸

1．完全缺陷噬菌體與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

（1）完全缺陷噬菌體感染宿主的噬菌體待成熟與進行包裝之際，極少數(shù)噬菌體（約10-6~10-8個）的衣殼將與其頭部DNA相似的一小段供體菌DNA片段誤包入其中，因此形成了完全不含噬菌體本身DNA的假噬菌體——完全缺陷噬菌體（轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，transducingparticle）。（2）普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體感染受體菌時，把供體菌DNA片段導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，而將供體菌的遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普通轉(zhuǎn)導(dǎo)。

一般用溫和噬菌體作為普通轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介。普通轉(zhuǎn)導(dǎo)又可分為以下兩種：完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)、流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（簡稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)、完全轉(zhuǎn)導(dǎo)

completetransduction）

由完全噬菌體導(dǎo)入的供體dsDNA片段可與受體細胞核染色體組上的同緣區(qū)段配對，再通過雙交換而整合到受體菌染色體組上，使受體菌成為一個遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。

外源dsDNA片段經(jīng)雙交換形成一穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子示意圖轉(zhuǎn)導(dǎo)模型——由P22噬菌體引起的完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

以Salmonell

tyhimutium為例，用野生型菌株作供體菌，營養(yǎng)缺陷型突變株作受體菌，P22噬菌體作轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介：

2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)）

經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)即不進行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，只進行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和表達的現(xiàn)象。2.部分缺陷噬菌體與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過部分缺陷噬菌體的媒介把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與受體菌基因整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。（1）部分缺陷噬菌體

前噬菌體脫離溶原菌的核基因組時，將其插入位點兩側(cè)之一的少數(shù)宿主基因連接到噬菌體的DNA上（而噬菌體也將相應(yīng)的一段DNA遺留在宿主的核染色體組上），通過衣殼的誤包就形成了一種特殊的噬菌體——部分缺陷噬菌體。（2）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)

由部分缺陷噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因總是限于臨近前噬菌體兩側(cè)的宿主基因，因此稱為局限轉(zhuǎn)導(dǎo)或限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子出現(xiàn)的頻率高低可以分為兩類：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、溶源轉(zhuǎn)變（lysogenicconversion）一個與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象溫和噬菌體感染細胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。（獲得新性狀的是溶源化的宿主細胞，而不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子）溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同：a）不攜帶任何供體菌的基因；b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；C）獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時消失.

(三)接合(conjugation)供體菌（F+）通過性菌毛與受體菌（F-）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，并使其獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞叫接合子。大腸桿菌的接合能進行接合的微生物種類：主要在細菌和放線菌中進行.細菌中，尤其G-菌較為普遍。接合還可發(fā)生在不同屬的一些菌種間。

F因子為附加體質(zhì)粒既可以脫離染色體在細胞內(nèi)獨立存在，也可插入（整合）到染色體上F因子的四種存在方式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。雄性菌株

Hfr菌株

F??菌株Ｆ－菌株（雌株）4種Ｆ因子的相互關(guān)系

F+菌株三者根本區(qū)別在于DNA轉(zhuǎn)移的方式不同

轉(zhuǎn)化：供體菌DNA片斷直接進入受體細胞。接合：供體菌DNA進入受體菌通過性菌毛。轉(zhuǎn)導(dǎo)：供體菌DNA片斷通過媒介－噬菌體攜帶進入受體菌。

(四)原生質(zhì)體融合

1.原生質(zhì)體融合通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體進行融合，借以獲得具有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。所獲得的重組子叫融合子。2.能進行原生質(zhì)體融合的生物種類原核生物和各種真核微生物和高等植物細胞。3.主要操作步驟

（1）選選擇親本細胞置于等滲溶液中；（2）用適當(dāng)?shù)拿摫诿赋ゼ毎?；?）將原生質(zhì)體離心聚集，加入促融合劑PEG（聚乙二醇）；（4）用等滲溶液稀釋；（5）涂在能促細胞壁再生和進行細胞分裂的基本培養(yǎng)基上；（6）用影印平板法將形成的菌落接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，檢驗其是否為穩(wěn)定的重組子；（7）測定其有關(guān)生物學(xué)性狀和生產(chǎn)性能。原生質(zhì)體融合的操作示意圖二、真核微生物的基因重組主要方式：有性雜交準性雜交原生質(zhì)體融合（略）轉(zhuǎn)化（略）真核微生物基因重組在有性繁殖過程中發(fā)生，當(dāng)合子減數(shù)分裂時，兩染色體發(fā)生交換。（一）有性雜交一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。酵母菌的有性雜交育種（一）酵母菌的生活史（二）酵母菌有性雜交技術(shù)酵母菌有性雜交程序一般為：親本的單倍化↓有性雜交↓雜交后代的檢出↓篩選優(yōu)良性狀個體S.Cerevisiae

的雙倍體和單倍體細胞的比較項目 雙倍體 單倍體細胞 大，橢圓形 小，球形菌落 大，形態(tài)均一 小，形態(tài)變化較多液體培養(yǎng) 繁殖快，細胞較分散 繁殖較慢，細胞常聚集成團在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上 形成子囊及子囊孢子 不形成子囊定義和意義：類似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通過同一物種兩個不同菌株的體細胞發(fā)生融合，不經(jīng)過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。為半知菌育種提供了一個重要手段。存在范圍：常見于一些真菌尤其是半知菌中（二）準性生殖（parasexualhybridization）

準性生殖的過程：①菌絲聯(lián)結(jié)②異核體形成（質(zhì)配）③核配形成雜合二倍體④體細胞交換和單倍體化。準性生殖與有性生殖的比較項目 準性生殖 有性生殖參與接合的親本細胞形態(tài)相同的形態(tài)或生理上有體細胞分化的性細胞獨立生活的異核體階段有 無接合后雙倍體細胞形態(tài)與單倍體與單倍體基本相同明顯不同雙倍體變單倍體的途徑通過有絲分裂 通過減數(shù)分裂接合發(fā)生的幾率 偶然發(fā)現(xiàn)， 正常出現(xiàn)，幾率低幾率高準性雜交：選擇親本：以來自不同菌株的合適的營養(yǎng)缺陷型為親本;強制異合：將兩菌親株的分生孢子（106~107）混合涂[-]平板，并做各單親本對照，[-]平板上長出的菌落是異核體或雜合二倍體;移單菌落：純化菌落，并將純化后的菌落移入[-]斜面;驗穩(wěn)定性：在[-]夾層平板上培養(yǎng)后，再倒上一層[+]，再培養(yǎng)后若出現(xiàn)大量新菌落，說明是不穩(wěn)定的異核體，反之是雜合二倍體;促進變異：用誘變劑進行處理，以促進染色體發(fā)生交換、染色體在子細胞分配不均、染色體缺失或畸變、點突變等，使分離后的子代提高增加新性狀的可能;篩選：通過一系列生產(chǎn)性壯的測定。Penicillum

urticae

的準性雜交步驟第四節(jié)

基因工程

一、基因工程（遺傳工程）

是一種人們利用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，自覺設(shè)計、操縱、改造和重建細胞的遺傳核心——基因組，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生定向變異，以最大限度滿足人類活動的需要的體外DNA重組技術(shù)。二、

基

因

工

程

的

基

本

操

作

1、目的基因的取得2、優(yōu)良載體的選擇3、目的基因與載體DNA的體外重組4、重組載體導(dǎo)入受體細胞5、重組受體細胞的篩選和鑒定6、“工程菌”或“工程細胞”的大規(guī)模培養(yǎng)三、基因工程的應(yīng)用

1、在生產(chǎn)多肽類藥物、疫苗中的應(yīng)用2、改造傳統(tǒng)發(fā)酵菌種3、動、植物特性的基因工程改良4、基因工程在環(huán)境保護中的應(yīng)用一、菌種的衰退與復(fù)壯二、菌種保藏第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異b）污染c）死亡一、菌種的衰退與復(fù)壯1）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2）有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護工作中不斷篩選“正變”個體。大量群體中的自發(fā)突變（二）菌種的復(fù)壯a）純種分離b）通過寄主體進行復(fù)壯（一）菌種衰退的特點（三）防止衰退的措施1）減少傳代次數(shù)2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件3）經(jīng)常進行純種分離，并對相應(yīng)的性狀指標進行檢查4）采用有效的菌種保藏方法

菌種是一個國家所擁有的重要生物資源。菌種保藏是一項重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作。

菌種保藏機構(gòu)的任務(wù)是在廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種、菌株（包括病毒株甚至動、植物細胞株和質(zhì)粒等）的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。為此，在國際上一些工業(yè)較發(fā)達的國家中都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機構(gòu)。例如：中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM）美國典型菌種保藏中心（ATCC）

二、菌種保藏菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異:(原理)

首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體（如分生孢子、芽孢等）；

其次還要創(chuàng)造一個適合其長期休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸度中和劑等。在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。在我國，菌種保藏一般用以下方法進行：①固體培養(yǎng)基斜面上定期移植法（4℃下保藏）；②石蠟油封藏法（室溫下保藏）；③冷凍干燥保藏法（10℃下保藏）；④砂土法保藏；⑤液體超低溫保藏法⑥此外，對絲狀真菌則另加麥麩皮法保藏等。

在國際著名的美國ATCC（AmericanTypeCultureCollection）中，目前已改為僅采用兩種最有效的方法，即保藏期一般達5～15年的冷凍干燥保藏法和保藏期一般達20年以上的液氮保藏法，以達到最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退的目的。

復(fù)習(xí)思考題：1、5、6、9、13、14、15、16、17、20、22、23、26、28。青霉素濃縮法培養(yǎng)基(含青霉素)

接入敏感菌液（含抗性突變株）涂布抗青霉素菌落培養(yǎng)+A+B+C-D-

維甲缺陷型A-B-C+D+

蘇賴缺陷型接合及其發(fā)現(xiàn)A+B+C+D+通過細胞間的直接接觸能進行大段ＤＮＡ的轉(zhuǎn)移的過程，叫接合異核體：同一菌絲有不同遺傳性狀的核在同一

細胞質(zhì)中生長。同核體：同一菌絲中只有一種核。異核體的特點：1）具有感受性的兩種菌絲間才可形成異核體；2）具有野生型性狀，可在基本培養(yǎng)基上生長；

（基因互補功能）3）大多數(shù)異核體的分生孢子不能在基本培養(yǎng)基

上生長；如能生長，則為異核體、或為雜合