第二章 第二節(jié) 微生物制藥工藝基礎

第二節(jié)微生物制藥工藝技術基礎一微生物菌種的選育與菌種保藏二微生物培養(yǎng)（自學）三發(fā)酵過程控制（自學）微生物菌種的選育與菌種保藏菌種分離與篩選菌種選育與保藏菌種分離與篩選分為三個步驟：含菌樣品收集、富集培養(yǎng)和菌種純化微生物制藥的關鍵技術微生物菌種選育工業(yè)發(fā)酵發(fā)酵產物的提煉技術質量控制一菌種的選育與保藏第二節(jié)微生物制藥工藝技術基礎菌種選育的目的防止菌種退化解決生產實際問題提高生產能力開發(fā)新產品菌種選育方法自然選育誘變育種自然選育多因素低劑量互變異構效應誘變育種物理化學生物突變株篩選隨機篩選半理性化篩選現代選育技術雜交育種原生質體融合基因工程技術物理因素：x射線、激光、紫外線、伽馬射線等化學因素：亞硝酸、黃曲霉素、堿基類似物等生物因素：某些病毒和細菌等①背景輻射和環(huán)境誘變

②生物自身所產生的誘變物質的作用

③堿基的異構互變效應菌種選育二菌種保存（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法①防止基因突變：如低溫保藏②采用雙重缺陷型③制作平行的菌種斜面，少傳代④分離單菌落，自然篩選⑤選擇培養(yǎng)條件退化意味著隨時間的推移菌種的一個或多個特性逐步減退或消失，最終導致營養(yǎng)細胞的死亡一般把菌株的生活力、產孢子能力的衰退和特殊產物產量的下降統稱為退化菌種退化的表現鑒別1單位容積中發(fā)酵液活性物質含量2瓊脂平皿上菌落形態(tài)3不同培養(yǎng)時期體細胞的形態(tài)和主要遺傳特征4發(fā)酵過程的pH變動情況5發(fā)酵味的氣味、色澤（4）菌種保藏方法：①斜面低溫保存②液體石蠟封藏法③甘油冷凍法④冷凍干燥法⑤液氮保藏法工業(yè)微生物菌種保藏技術斜面低溫保藏法礦物油中浸沒保藏法固體曲保藏法砂土管保藏法普通冷凍保藏超低溫冷凍保藏法冷凍干燥法液氮冷凍保藏法寄主保藏斜面低溫保藏本方法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短時期內保持不變將新鮮瓊脂培養(yǎng)基斜面上長好的菌體或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌種均可用此方法保存1～3個月保存期間要注意冰箱的溫度，不可波動太大，不能在0℃以下保存，否則培養(yǎng)基會結冰脫水，造成菌種性能衰退或死亡此法最為簡單和經濟，且不要求任何特殊的設備?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉接菌量應保持較低水平斜面培養(yǎng)物應在密閉容器中于5℃保藏，一般不適宜作工業(yè)生產菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫或4℃冰箱保存，此方法簡便有效。保存期約1年

可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經170℃下滅菌1-2h的礦物油(液體石蠟可采用蒸汽滅菌，滅菌后的石蠟在40℃烘箱中烘干備用)。礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜

以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏為了預防不測，一般保藏株2～3年也應做一次存活試驗固體曲保藏法這是根據我國傳統制曲原理加以改進的一種方法，適用于產孢子的真菌。該法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農產品為產孢子培養(yǎng)基，使菌種產生大量的休眠體（孢子）后加以保存。該法的要點是控制適當的水分砂土管保藏法本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于產孢子的放線菌、霉菌以及產芽孢的細菌砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般為3：2或1：1，將黃砂和泥土分別洗凈，過篩，一般沙用80目過篩，土用80～100目過篩。按比例混合后，裝人小試管內，裝料高度約為1cm左右，121℃間歇滅菌2～3次，滅菌后烘干，并作無菌檢查后備用將要保存的菌種斜面孢子刮下，直接與砂土混合；或用無菌水洗下孢子，制成懸浮液，再與砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或無水氯化鈣的干燥器中，用真空泵抽氣干燥后，放在干燥低溫環(huán)境下保存。此法保存期可達1年以上普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為-20℃，為了避免微生物受損傷致死，需要甘油作為保護劑。甘油的最終濃度為25%具體操作如下：①配制濃度為50％的甘油溶液，121℃滅菌后備用；②制備菌懸液，一般菌懸液的濃度為108～1010個／mL；③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后，置-20℃保藏或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存用此方法可以維持若干微生物的活力1~2年應注意的是經過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在：-60～-80℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響液氮冷凍保藏法原理用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達-196℃，遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度（-130℃），所以此時菌種的代謝活動已基本停止，化學作用亦隨之消失此法國外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產孢子的菌絲體，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最長。我國國內目前已有很多單位采用液氮法保存菌種寄主保藏適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒冷凍干燥法基本原理是在較低的溫度下（-18℃），快速地將細胞凍結，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因而能長期保存，一般為5～10年此法適于各種微生物具體的做法是先將微生物制成懸浮液，與保護劑（一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管內，用低溫酒精或干冰（-15℃以下）使之速凍，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，低溫保存?zhèn)溆媒泝龈珊蟮木隉o需進行冷凍保藏，便于運輸培養(yǎng)物的凍干過程抽真空最終菌株濃度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細菌群落總數菌種保藏的注意事項1在整個保藏處理過程中要防止雜菌污染，并一定要做無菌檢查2保藏所用的菌種要在新鮮的斜面上生長豐滿，生長時間不宜過長3保藏過程中要防止菌種退化現象的發(fā)生，及時采用有效方法復壯、傳代次數過多容易退化4菌種制備過程是保持菌種優(yōu)良特性的一個重要環(huán)節(jié)。接種斜面不宜過密，接種量必須控制適當，使菌落能充分生長好

凍干菌種的再生復蘇

在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板

在管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基國內外主要菌種保藏機構介紹（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection。Rockvil1．Maryland.U.S.A.

美國標準菌種收藏所，美國，馬里蘭州，羅克維爾市.（2）CSHColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.

冷泉港研究室，美國.（3）IAMInstituteofAppliedMicrobiology.UniversityofTokyo，Japan.

日本東京大學應用微生物研究所，日本東京.（4）IFOInstituteforFermentation.Osaka，Japan.

發(fā)酵研究所，日本大阪.（5）KCCKakenChemicalCompanyLtd．Tokyo，Japan.

科研化學有限公司，日本東京.（6）NCTCNationalCollectionofTypeCulture.London，UnitedKingdom.

國立標準菌種收藏所，英國倫敦.（7）NIHNationalInstitutesofHealth.Bethesda，Maryland，U.S.A.

國立衛(wèi)生研究所，美國，馬里蘭州，貝塞斯達.（8）NRRLNorthernUtilizationResearchandDevelopmentDivision，U.S.DepartmentofArgiculture.Peoria，U.S.A.

美國農業(yè)部