第十六章與微生物有關(guān)的藥物制劑

第十六章與微生物有關(guān)的藥物制劑

抗生素維生素氨基酸酶及酶抑制劑

低成本、高質(zhì)量的藥物

第一節(jié)抗生素

目前從自然界發(fā)現(xiàn)和分離的抗生素已達(dá)10，000多種，實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)和醫(yī)療上的抗生素約有一百多種，連同各種半合成衍生物及其鹽類共約三百種?？股厥侵盖嗝顾亍㈡溍顾氐纫活惢衔锏目偡Q，是人類控制、治療感染性疾病，保障身體健康及用來(lái)防治動(dòng)植物災(zāi)害的重要化合物。原始含義：是指那些由微生物產(chǎn)生的、能抑制其微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)。習(xí)慣上：將那些由微生物產(chǎn)生的，極微量即具有選擇性地抑制其他微生物或腫瘤細(xì)胞的天然有機(jī)化合物稱為抗生素。

一、抗生素的概念和分類

(一)抗生素的概念

抗生素是生物(包括微生物、植物和動(dòng)物)在其生命活動(dòng)過(guò)程中所產(chǎn)生的(或有其他方法獲得的)，能在低濃度下選擇性地抑制或影響他種生物功能的有機(jī)物質(zhì)。（二）抗生素的分類

1、根據(jù)抗生素的生物來(lái)源分類

2、根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

3、根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類

4、根據(jù)抗生素的作用對(duì)象分類

二、醫(yī)療用抗生素的基本要求1．差異毒力大2、生物活性強(qiáng)3、有不同的抗菌譜4、不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性

三、尋找新抗生素的基本程序絕大多數(shù)抗生素的原始產(chǎn)生菌是從自然界分離篩選獲得，以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例，說(shuō)明新抗生素產(chǎn)生菌的常規(guī)分離和篩選過(guò)程。

（一）土壤微生物的分離

1、采土以春、秋兩季采土為宜。去除表土，采取5-10cm深處的土壤，裝入無(wú)菌容器。

2、分離菌株將2-4克土壤均勻散布水中待其沉降，上清部分經(jīng)適當(dāng)稀釋后（一般為10-3-104），涂布于適宜培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取單個(gè)菌落移種純培養(yǎng)，根據(jù)菌落的特征，初步排除相同菌。

（二）篩選是指從大量待篩選微生物中，盡快地鑒別出有實(shí)用價(jià)值的抗生素產(chǎn)生菌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

1、篩選模型：

是指篩選工作中所使用的實(shí)驗(yàn)菌。為了避免感染病原菌的危險(xiǎn)，盡可能選用非致病的、且能代表某些類型致病菌的微生物作為實(shí)驗(yàn)菌。

表17-1常用的實(shí)驗(yàn)菌和代表的致病微生物

實(shí)驗(yàn)菌代表的致病微生物

金黃色葡萄球菌革蘭陽(yáng)性球菌枯草芽孢桿菌革蘭陽(yáng)性桿菌恥垢分支桿菌結(jié)核分枝桿菌大腸埃希菌革蘭陰性桿菌白假絲酵母菌酵母狀真菌曲霉絲狀真菌噬菌體病毒、腫瘤細(xì)胞

2、篩選方法

抗菌抗生素一般采用瓊脂擴(kuò)散法。先制備含實(shí)驗(yàn)菌的平板，然后以無(wú)菌濾紙片蘸取各放線菌的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。

（三）早期鑒別

經(jīng)過(guò)篩選的陽(yáng)性菌應(yīng)進(jìn)一步做抗菌譜和抗藥譜的測(cè)定，對(duì)有價(jià)值的產(chǎn)生菌必須從產(chǎn)生菌及自該菌產(chǎn)生的抗生素兩方面進(jìn)行鑒定。

1、抗生素產(chǎn)生菌的鑒別

通過(guò)形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)對(duì)抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行初步的分類鑒定。

2、抗生素的鑒別常用理化方法如：紙層析法測(cè)定抗生素的極性和在各種溶媒中的溶解度。紙電泳法判斷抗生素是酸性、堿性、中性或兩性。

薄層層析法、高效液相層析法、紫外分光光度法等方法測(cè)定新抗生素的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。

（四）分離精制將可能產(chǎn)生新抗生素的放線菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后選擇合適的方法從培養(yǎng)液中提取有效抗生素，進(jìn)一步精制純化。在此過(guò)程中，須跟綜測(cè)定抗生素的生物活性。

（五）臨床前實(shí)驗(yàn)研究如：進(jìn)行動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)（急性、亞急性、慢性）動(dòng)物治療保護(hù)性實(shí)驗(yàn)臨床前藥效實(shí)驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)（抗生素在體內(nèi)吸收、分布、排泄），經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)認(rèn)為確有前途的新抗生素經(jīng)有關(guān)部門(mén)審查合格后方可進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。國(guó)家制定了《藥品臨床前研究質(zhì)量管理規(guī)范》，（簡(jiǎn)稱GLP）。

（六）臨床實(shí)驗(yàn)

《藥品臨床實(shí)驗(yàn)管理規(guī)范》簡(jiǎn)稱GCP，是臨床實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程，包括方案設(shè)計(jì)、組織實(shí)施、監(jiān)視、審核、記錄、分析、總結(jié)和報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)。四、抗生素的制備概況

抗生素的制備分為發(fā)酵和提取兩個(gè)階段。

抗生素的發(fā)酵：是指抗生素產(chǎn)生菌在一定培養(yǎng)基條件下生物合成抗生素的過(guò)程，該過(guò)程又分為菌體生長(zhǎng)和抗生素生物合成兩個(gè)部分。發(fā)酵后存在于發(fā)酵液中的抗生素需用一系列物理和化學(xué)方法進(jìn)行提取和精制，得到抗生素成品。抗生素生產(chǎn)大致分為二個(gè)階段：發(fā)酵和提取一般流程如下：

菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理及壓濾→提取及精制→成品檢驗(yàn)→成品包裝

一、發(fā)酵階段

（一）現(xiàn)代抗生素發(fā)酵的一般特點(diǎn)

1、需氧發(fā)酵抗生素產(chǎn)生菌多為需氧菌，需要在發(fā)酵的過(guò)程中不斷通入無(wú)菌空氣，并進(jìn)行機(jī)械攪拌，以提供足夠氧來(lái)進(jìn)行生物代謝和生物合成。

2、深層發(fā)酵（或?yàn)槌翛](méi)發(fā)酵），在大型發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，可進(jìn)行較大規(guī)模的生產(chǎn)。

3、純種發(fā)酵在純種培養(yǎng)的抗生素發(fā)酵工業(yè)中，應(yīng)防止雜菌及噬菌體污染。(二)一般生產(chǎn)流程

抗生素發(fā)酵階段一般主要包括：孢子制備、種子制備和發(fā)酵，這是進(jìn)行微生物逐步擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程。

1、孢子制備目的是將沙土管保存的菌種進(jìn)行培養(yǎng)，以制備大量孢子供下一步種子制備之用，一般于試管、扁瓶或搖瓶?jī)?nèi)進(jìn)行。

2、種子制備目的是使有限數(shù)量的孢子發(fā)芽繁殖，獲得足夠菌絲體以供發(fā)酵之用。在種子罐內(nèi)進(jìn)行。通過(guò)種子制備，可以縮短發(fā)酵罐內(nèi)菌絲體繁殖生長(zhǎng)的時(shí)間，增加抗生素合成的時(shí)間。一般通過(guò)種子罐1-3次，再移種到發(fā)酵罐中，分別為二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)發(fā)酵。

3、發(fā)酵關(guān)鍵階段目的是在人工培養(yǎng)條件下使菌絲體產(chǎn)生大量的抗生素。在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。發(fā)酵注意事項(xiàng)：

1)無(wú)菌操作污染雜菌主要是種子和空氣過(guò)濾系統(tǒng)污染，各部件滲漏及操作。在發(fā)酵的各階段應(yīng)取樣進(jìn)行雜菌檢查。

2)營(yíng)養(yǎng)需要發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)供給微生物生產(chǎn)繁殖以及生物合成所需的營(yíng)養(yǎng)，其原料應(yīng)盡可能價(jià)廉，來(lái)源要廣。

3)pH值：加入使培養(yǎng)基pH值恒定的化合物：硫酸銨、硝酸鈉。

4)溫度酶的催化需要合適的溫度?？赏ㄟ^(guò)罐的夾套或蛇管導(dǎo)入冷水或熱水以控制罐溫。

5)前體前體→是抗生素分子的前身或其組成的一部分，直接參與抗生素的生物合成而自身無(wú)顯著變化。在一定條件下，加入前體可控制抗生素的合成方向，并增加產(chǎn)量。如：在青霉素G的生產(chǎn)中常加入苯乙酸或苯乙酰胺作為前體；在紅霉素生產(chǎn)中添加丙酸、丙醇鹽作為前體。但前體一般對(duì)產(chǎn)生菌有一定的毒性。

6)通氣、攪拌及消沫發(fā)酵過(guò)程中利用溶解氧，因此必須不斷經(jīng)空氣過(guò)濾系統(tǒng)輸入無(wú)菌空氣，同時(shí)在發(fā)酵罐內(nèi)設(shè)置攪拌和擋板以增加通氣效果。為防止泡沫造成的逃液和滲漏，需用消沫漿或消沫劑。7)發(fā)酵終點(diǎn)判斷定期取樣，測(cè)定抗生素含量、發(fā)酵液的pH值、含糖量和含氮量、菌絲含量及形態(tài)觀察。放罐應(yīng)在產(chǎn)量的高峰期，過(guò)早或過(guò)遲都會(huì)影響抗生素含量。二、發(fā)酵液預(yù)處理及提取階段

預(yù)處理時(shí)應(yīng)盡可能使抗生素轉(zhuǎn)入以后要處理的相中（多數(shù)是液相），可用調(diào)節(jié)pH值呈酸性或堿性的方法。預(yù)處理的主要任務(wù)是除去發(fā)酵液內(nèi)的雜質(zhì)（Ca、Mg、Fe）及蛋白質(zhì)，并經(jīng)過(guò)過(guò)濾，使菌絲與濾液分開(kāi)，便于進(jìn)一步提取。常用的提取方法主要有四類：

1、溶媒萃取法是用一種溶劑將物質(zhì)從另一種溶劑中提取出來(lái)的方法，這兩種溶劑不能互溶或只部分互溶，能形成便于分離的兩相。目前微生物制藥生產(chǎn)中常用的提取方法。先進(jìn)的萃取設(shè)備：ABE-216萃取機(jī)

2、離子交換法離子樹(shù)脂交換法是應(yīng)用離子交換樹(shù)脂作為吸附劑，將發(fā)酵液中物質(zhì)選擇性地吸附至離子交換樹(shù)脂上，然后用合適的洗脫劑將抗生素從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，達(dá)到分離、濃縮、提純的目的。由于費(fèi)用較低，成為提取主要方法。如：鏈霉素和卡那霉素的生產(chǎn)。

3、沉淀法是利用等電點(diǎn)或能與酸、堿、金屬鹽類形成不溶性或溶解度極小的復(fù)鹽沉淀出抗生素。此法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。如：四環(huán)素4、吸附法是利用適當(dāng)?shù)奈絼?，在一定的PH條件下，使發(fā)酵液中抗生素被吸附劑吸附，然后再以適當(dāng)?shù)南疵搫⑽降目股貜奈絼┥舷疵撓聛?lái)，達(dá)到濃縮和提純目的。隨著大網(wǎng)格聚合物吸附劑的合成成功，吸附法得到新的發(fā)展。

抗生素提取得到粗品后應(yīng)加以精制，上述方法均可使用。一般用多級(jí)溶劑萃取或多級(jí)吸附、洗脫或薄層層析、柱層法、葡聚糖凝膠過(guò)濾等。因一般抗生素的穩(wěn)定性差，應(yīng)避免常壓蒸餾、升華、過(guò)酸或過(guò)堿等方法。五、抗生素的效價(jià)和單位

一、抗生素的效價(jià)和單位抗生素是一種生物活性物質(zhì)，可以利用抗生素對(duì)生物所起作用的強(qiáng)弱來(lái)判定抗生素的含量。含量通常用效價(jià)或單位表示。有時(shí)二者合稱效價(jià)單位。

效價(jià)（potency）:指在同一條件下比較抗生素的檢品和標(biāo)準(zhǔn)品的抗菌活性，從而得出檢品的效價(jià)。即效價(jià)是檢品的實(shí)際單位數(shù)與其標(biāo)準(zhǔn)量的比值。常用百分?jǐn)?shù)表示。

單位（unit，u）是衡量抗生素有效成分的具體尺度。有以下幾種：

1、重量單位以抗生素的生物活性部分的重量作為單位。1mg=1000單位（u），對(duì)于不同鹽類的同一抗生素，只要它們的單位相同，即使鹽類重量不同，其實(shí)際有效含量是一致的。如:鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽、新霉素鈉（鉀）鹽等以重量單位表示。

2、類似重量單位是以特定的抗生素鹽類純品的重量為單位，包括非活性部分重量如：純金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽，1微克=1單位。

3、重量折算單位以原始的生物活性單位相當(dāng)?shù)膶?shí)際重量為1單位加以折算。

如：青霉素最初確定一個(gè)青霉素單位系指在50ml肉湯培養(yǎng)基內(nèi)完全抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最小青霉素量為1單位。青霉素純化后，這個(gè)量相當(dāng)于青霉素G鈉鹽0.5988微克，因而國(guó)際上一致規(guī)定：0.5988微克為1單位，則1mg=1670單位。

4、特定單位以特定的一批抗生素樣品的某一重量作為一定單位，經(jīng)有關(guān)的國(guó)家機(jī)構(gòu)認(rèn)可而定。如：特定的一批菌肽1mg=3000單位標(biāo)準(zhǔn)品與國(guó)際單位（internationalunit，IU）

標(biāo)準(zhǔn)品：是指與商品同質(zhì)的、純度較高的抗生素，每毫克含有一定量的單位，可供作測(cè)定效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)國(guó)際協(xié)議，每毫克含一定量的標(biāo)準(zhǔn)品稱為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，其單位即為國(guó)際單位。

抗生素的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品是在聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織的生物檢定專家委員會(huì)的主持下,委托指定的機(jī)構(gòu)(主要是英國(guó)國(guó)立生物標(biāo)準(zhǔn)檢定所)組織標(biāo)定、保管和分發(fā).

我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品由衛(wèi)生部藥品生物檢定所檢定和分發(fā)。

標(biāo)示量:抗生素制劑標(biāo)簽上的標(biāo)示量原則上以重量表示(指重量單位),但少數(shù)成分不清的抗生素(如制霉菌素),或照顧用藥習(xí)慣(如青霉素),仍沿用單位表示.六、細(xì)菌的抗藥性常見(jiàn)的臨床致病菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、大腸埃希菌、志霍菌屬等抗藥情況突出。所引起的各種感染已成為臨床治療上的一大難題。

（一）抗藥性的基本概念

抗藥性（drugresistance）：

指在微生物或腫瘤細(xì)胞多次與藥物接觸發(fā)生敏感性降低的現(xiàn)象，是微生物對(duì)藥物所具有的相對(duì)抗性?？顾幮缘某潭纫话阋栽撍帉?duì)某種微生物的最小抑菌濃度來(lái)衡量。

有些微生物由于具有一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)或代謝，天生對(duì)藥物不敏感，根據(jù)抗藥性的概念，就不能稱之為抗藥性，這種現(xiàn)象可稱為天然不敏感性（過(guò)去稱為固有抗藥性）。如：銅綠假單胞菌對(duì)多種藥物不敏感。

微生物個(gè)體對(duì)原來(lái)敏感的抗生素通過(guò)遺傳性的改變而獲得了抗藥性，可稱之為獲得抗藥性，常常是臨床上不合理用藥或長(zhǎng)期用藥之后表現(xiàn)出的抗藥性。

多重抗藥性：

指某一些微生物可同時(shí)對(duì)兩種以上作用機(jī)制不同的藥物所產(chǎn)生的抗藥性，也稱為多劑抗藥性，這是由于多重抗藥性菌株的遺傳物質(zhì)上帶有多種抗藥性基因。

交叉抗藥性：有些微生物對(duì)結(jié)構(gòu)類似或作用機(jī)制類似的抗生素均有抗藥性的現(xiàn)象。賴藥性：由于基因突變而致的抗藥性，不僅對(duì)該藥具有抗性，而且需要該藥物作為特殊營(yíng)養(yǎng)因素，這種現(xiàn)象稱為賴藥性。

耐受性（tolerance）：有一些微生物對(duì)藥物抑菌作用的敏感性未改變，而對(duì)藥物的殺菌作用具有相對(duì)抗性，即該菌在最低抑菌濃度時(shí)仍受到抑制，但最小殺菌濃度提高，抗生素此時(shí)表現(xiàn)的是抑菌，而不是殺菌作用，這種現(xiàn)象稱為耐受性。（二）抗藥性產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制

微生物對(duì)藥物的抗藥性可由染色體或質(zhì)粒，或兩者兼有介導(dǎo)。大多數(shù)抗藥性由質(zhì)粒編碼，少數(shù)由染色體編碼。產(chǎn)生抗藥性的原因可能是染色體或質(zhì)粒上帶有與抗藥性有關(guān)的基因。如：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，帶有一種與抗藥性相關(guān)的mecA基因。有些具有多重抗藥性的菌株，可能含有兩個(gè)以上的抗藥質(zhì)粒，或其抗藥質(zhì)粒上可能含有多個(gè)抗藥基因。

1、自發(fā)突變加藥物選擇一般認(rèn)為，抗藥菌所含的抗藥基因是由敏感菌的遺傳物質(zhì)自發(fā)突變產(chǎn)生的，但突變率極低，在10-10-10-6。極少量的抗藥菌存在于大量的敏感菌不足為害，但經(jīng)臨床頻繁使用抗生素后，藥物殺死或抑制敏感菌的生長(zhǎng)，而抗藥性細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，無(wú)形中對(duì)抗藥菌起了選擇作用，造成抗藥菌株的大量增殖，形成抗藥菌系。許多實(shí)驗(yàn)證明，抗藥性的產(chǎn)生不是由于微生物與藥物接觸而產(chǎn)生的，而是自發(fā)突變加上藥物選擇的結(jié)果。

2、細(xì)胞間抗藥性的基因轉(zhuǎn)移染色體上的抗藥性可以通過(guò)三種機(jī)制由一個(gè)細(xì)菌傳遞到另一個(gè)細(xì)菌：

1）接合帶有抗藥性基因的質(zhì)?？勺孕袕?fù)制，代代相傳，并在不同種屬間（特別是腸道）進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而導(dǎo)致抗藥性的廣泛散播。如：1958年日本爆發(fā)痢疾大流行發(fā)現(xiàn)：攜帶黃胺、四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素等抗藥基因的大腸埃希菌在腸道內(nèi)通過(guò)接合將多種抗藥性基因轉(zhuǎn)移給痢疾桿菌，從而抗藥性的散播。

2）轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)噬菌體將細(xì)菌染色體片段由供體菌株向受體菌株轉(zhuǎn)移。當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)片段中含有抗藥性的遺傳因子時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)將導(dǎo)致抗藥性的傳播。但頻率不高。

3）轉(zhuǎn)化不重要

4）一些微生態(tài)制劑的活菌細(xì)胞中可能攜帶有一定的抗藥性基因，由于廣泛大量地被服用，也可能造成抗藥性的傳播。

5）轉(zhuǎn)座子在細(xì)胞間抗藥性的基因轉(zhuǎn)移中，起重要作用。（三）抗藥性產(chǎn)生的生物化學(xué)機(jī)制

是指抗藥菌遺傳學(xué)上的改變?cè)谏锘瘜W(xué)上的表現(xiàn)。主要有三方面：

1、產(chǎn)生使抗生素結(jié)構(gòu)改變的酶（即鈍化酶）

2、抗生素作用靶位的修飾

3、細(xì)胞膜通透性改變

（四）抗藥性的控制

1、合理使用抗生素不必使用抗生素時(shí)盡可能不用，防止交叉抗藥性。同時(shí)注意聯(lián)合用藥，因每一種藥物在代謝過(guò)程中發(fā)生作用的部位不同，聯(lián)合服用兩種藥物可起到協(xié)同作用。

2、尋找新藥尋找具有新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的新抗生素以及新的酶抑制劑，改造現(xiàn)有的抗生素（包括對(duì)現(xiàn)有的產(chǎn)生菌和抗生素的改造）。目前半合成抗生素的使用己成為克服抗藥性的主要途徑。

3、加強(qiáng)抗藥機(jī)制的研究研究抗藥機(jī)制，有助于了解細(xì)菌抗藥性的本質(zhì)，有效地控制細(xì)菌感染。第二節(jié)維生素

一、維生素C

維生素c的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化并用的半合成法。

20世紀(jì)70年代，我國(guó)為簡(jiǎn)化工藝，研究成功了采用微生物法使L—山梨醇轉(zhuǎn)化生成2—酮