第3章 液相色譜分析

第三章

高效液相色譜分析3-1高效液相色譜法3-2流程及主要部件3-3影響分離的因素3-4高效液相色譜法的主要分離類型HighPerformanceliquid

Chromatograph,

HPLC

2023/2/5一、HPLC發(fā)展歷史§3-1高效液相色譜法簡介二、

特點高壓、高速、高效、高靈敏度經(jīng)典LCHPLC2023/2/5§3-1高效液相色譜法簡介三、種類四、應(yīng)用液-固色譜液-液色譜離子交換色譜凝膠色譜生化分析、食品分析、環(huán)境分析、醫(yī)藥分析……2023/2/5五高效液相色譜儀組成2023/2/52023/2/5高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)流程圖2023/2/5HPLC儀包括：高壓輸液裝置;進樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測系統(tǒng);和數(shù)據(jù)處理裝置。此外還配有梯度淋洗、餾分收集器。

2023/2/51.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔約2m，可防止顆粒物進入泵內(nèi)。

脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。2023/2/52）高壓泵：要求：密封性好、壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕種類：恒壓泵和恒流泵。恒壓泵（氣動放大泵）：利用大面積的其他活塞驅(qū)動小面積液體活塞面，按照活塞面積比，以很小的氣體壓力可達到相當(dāng)高的液壓把流動相送入色譜柱。體積和重量都很大，現(xiàn)僅作為液相色譜柱的填裝泵使用

2023/2/5恒流泵（往復(fù)泵）：是目前液相色譜使用最普遍的一種高壓泵，優(yōu)點是泵頭內(nèi)腔體積小，容易清洗，便于換溶劑。單頭往復(fù)泵：單頭往復(fù)泵依靠變速同步電機驅(qū)動曲軸，然后帶動寶石柱前后往復(fù)運動，流動相則從下面通過單向閥吸入泵體，并由上部通過單向閥送出。改變沖程頻率可以控制流速雙頭往復(fù)泵：由電機帶動凸輪轉(zhuǎn)動，兩個寶石柱塞桿隨之往復(fù)運動、吸入和送出流動相。因為兩個柱塞桿來回移動有一個時間差，正好補償流動相輸出的脈沖，使得流速相當(dāng)平穩(wěn)2023/2/52.梯度洗提裝置：梯度洗提：就是載液中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的容量因子和選擇因子，以提高分離效果。應(yīng)用梯度洗提可以提高分離效果，縮短分析時間，提高分辨能力和定量分析的精度。注意：（1）溶劑純度高，以保證良好的重現(xiàn)性（2）溶劑需互溶，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相（3）每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)2023/2/53.進樣系統(tǒng)進樣裝置包括兩種：1）微量注射器進樣：2023/2/52）高壓定量進樣閥：常用的為六通閥。進樣量由樣品管控制，進樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。2023/2/54.色譜柱1）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內(nèi)徑為4.6或3.9mm標(biāo)準(zhǔn)柱。2）柱的填充：

主要采用勻漿法。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；常用的填料是新型健合相填料，粒度3-10微米。

填充方法：填充時，先制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進入。2023/2/5

（l）紫外檢測器

（2）熒光檢測器

（3）示差折光率檢測器

（4）電導(dǎo)檢測器

5.檢測器作用？——將經(jīng)色譜柱分離后的各組分按其特性及含量轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號。HPLC檢測器類型2023/2/5

特點：靈敏度高，最小檢測濃度達10-9g/mL；流通池體積小（容積8-10μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫

應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)(1).紫外檢測器（Ultrvioletphotometricdetector）2023/2/52023/2/5紫外普通檢測器和光電二極管陣列檢測器的比較普通檢測器光電二極管陣列檢測器2023/2/5波長可的松氟美松皮質(zhì)酮由光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖。利用色譜保留值及光譜特征吸收曲線綜合進行定性分析。2023/2/5(2).熒光檢測器（fluorescencedetector）特點：高靈敏度，最小檢測濃度達10-11g/mL；高選擇性，對具有共軛結(jié)構(gòu)的有機芳環(huán)分子(剛性結(jié)構(gòu)強)有響應(yīng)。

如多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、甾類化合物等有響應(yīng).2023/2/5(3).示差折光檢測器（differentialrefractiveindexdetector）檢測原理：連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與流動相中的組分濃度成正比；2023/2/5通用型檢測器（不同的物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；

靈敏度低10-7g/mL。對溫度敏感(檢測器溫度應(yīng)控制在±10-3℃)梯度洗脫會造成流動相折光指數(shù)不斷變化，故不能用于梯度洗脫。

特點：2023/2/5電導(dǎo)檢測器屬于電化學(xué)檢測器，主要用于離子色譜的檢測。檢測原理：基于待測物在一些介質(zhì)中解離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來測量解離物質(zhì)的含量。特點：通用型檢測器，檢測靈敏度低。背景電導(dǎo)低時，采用雙電極電導(dǎo)檢測器(p90,圖3-13）。當(dāng)背景電導(dǎo)大時，應(yīng)采用五電極式電導(dǎo)檢測器(p91,圖3-15)

響應(yīng)受溫度影響較大，需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。當(dāng)pH>7時，該檢測器不夠靈敏。

(4).電導(dǎo)檢測器（electricalconductivitydetector）2023/2/5

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即：

H=A+Cu

如圖所示：H～u曲線是一段斜率不大的直線。而在高的流動相流速下不致于使柱效損失太大，所以在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要參數(shù)。流速大于0.5cm/s時,降低流速，柱效提高不是很大。§3-3影響HPLC分離的因素2023/2/5A─渦流擴散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子Cu─傳質(zhì)阻力項傳質(zhì)阻力包括固定相傳質(zhì)阻力Cs和流動相傳質(zhì)阻力Cm(包括在流動的流動相中的傳質(zhì)和滯留的流動相中的傳質(zhì))：

C=（Cs+Cm+Csm）柱內(nèi)色譜峰展寬引起H的變化：2023/2/5提高液相色譜的柱效方法：

柱填充顆粒小且均勻；流動相流速較低，粘度要?。恢鶞馗?/p>

流速選擇原則：柱效損失不太大的前提下提高流動相流速以實現(xiàn)快速分離。2023/2/5影響色譜峰擴展的因素的柱外因素：

柱前展寬：由進樣引起。若將試樣直接注入到色譜柱頂端填料中心點，或注入到填料中心之內(nèi)1-2mm處，可減小柱前展寬，提高柱效。

柱后展寬：由接管，檢測器流通池的死體積所引起。2023/2/5一、液—液分配色譜原理

根據(jù)各待測物在互不相溶的液體中溶解度不同，具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。

§3-4高效液相色譜的主要類型及分離原理按分離原理，HPLC分離的主要類型？

用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。2.應(yīng)用2023/2/53.固定相

液液色譜的固定相選擇較簡單，常用的只有幾種，如,’-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷(C18)、角鯊?fù)?。固定相涂漬方法:1）機械涂漬固定相：將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體上(5-10%涂布量)。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

如何減少固定液的流失？

機械涂漬型和化學(xué)鍵合型。2023/2/5

如何減少固定液的流失？方法一、固定相和流動相之間溶解度越小越好（兩者極性差別越大越好）

方法二、在柱前加一根很短的前置柱(該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和)或?qū)⒐潭ㄒ航『系捷d體上。方法三、使固定液在擔(dān)體上結(jié)合更牢固2023/2/52）化學(xué)鍵合固定相通過化學(xué)反應(yīng)將各種不同的有機基團鍵合到載體(硅膠)表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。這種固定相分離機理：液液分配？雙重分離機制，即液液分配+吸附取決于化學(xué)鍵合的表面覆蓋率。

高覆蓋率：液液分配為主；低覆蓋率：吸附為主?；瘜W(xué)鍵合固定相的類型：2023/2/5化學(xué)鍵合固定相類型

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N2023/2/54.流動相:

在液液色譜中，為防止固定相的流失，流動相液體與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。反相健合相色譜法固定相:硅膠一C18H37、硅膠一苯基等流動相:甲醇\乙睛一水、水+無機鹽buf溶液等正相健合相色譜法固定相:硅膠一OH、硅膠一CN等流動相:正已烷中加入適量極性溶劑,如氯仿\醇等2023/2/5A>B>C正相色譜低極性流動相反相色譜高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系?待測物極性：2023/2/5二、液固吸附色譜

固定相:固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，粒度5～10μm。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。作用機理：根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。當(dāng)流動相進入色譜柱后，它以單分子層S形式占據(jù)吸附劑上的活性中心點，當(dāng)試樣分子X進入色譜柱后，在遷移過程中，與流動相分子在固定相表面發(fā)生競爭吸附反應(yīng)：這種競爭吸附達平衡時，吸附的分配系數(shù)K為：K越大，溶質(zhì)分子的吸附性強，保留值大。應(yīng)用：相對分子質(zhì)量中等的油溶性樣品，不同官能團化合物、異構(gòu)體。

2023/2/5三、離子對色譜法（IPC）

原理主要是基于待測組分在分析柱上的吸附作用不同而進行分離的。將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對化合物，利用它在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而進行分離。

固定相疏水性的苯乙烯、二乙烯苯樹脂或鍵合的硅膠流動相水+離子對試劑+有機溶劑

離子對試劑所帶電荷與待測離子相反的離子2023/2/5可以通過改變對離子的濃度和種類，流動相的類型、濃度及pH值從而改變分離的選擇性，解決難分離混合物的分離問題。平衡常數(shù)KXY為:

根據(jù)分配系數(shù)的定義，溶質(zhì)的分配系數(shù)D為：例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子X+有相反電荷的離子Y-：

2023/2/52離子對試劑的選擇（1）分離親水性離子——選用疏水性離子對試劑分離疏水性離子——選用親水性離子對試劑（2）相對分子量較小的離子對試劑比分子量的分離效果更好2023/2/5思考題：有一強極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來形成離子對？離子對色譜法的應(yīng)用分離大分子量的陰、陽離子，特別是帶局部電荷的大分子及疏水性陰、陽離子。包括陰陽離子表面活性劑，大分子脂肪羧酸、烷基磺酸鹽和芳香硫酸鹽、季銨化合物、水溶性維生素、酚類等2023/2/5

IEC是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。四、離子交換色譜（IEC）1.原理固定相為離子交換樹脂，可解離出離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。2023/2/52023/2/52.固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。離子交換劑有陽離子交換劑和陰離子交換劑。2023/2/5一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的對樹脂的親和力大小順序為：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價離子的順序為：Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對于季銨型陰離子交換樹指，陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞IO3-＞CH3COO-＞F-2023/2/5凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。4.應(yīng)用3.流動相

鹽類緩沖溶液（有一定pH和離子強度）。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。2023/2/5產(chǎn)生背景：離子交換色譜法淋洗液幾乎都是強電解質(zhì)，電導(dǎo)比待測離子高兩個數(shù)量級，被測離子的電導(dǎo)信號被強電解質(zhì)流動相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法用電導(dǎo)檢測器檢測；而多數(shù)無機離子沒有紫外吸收，不能用紫外檢測器檢測。

五、離子色譜離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。2023/2/5

例如：分析陰離子時，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+NaBr

R+—Br-+NaOH流動相的高背景電導(dǎo)如何轉(zhuǎn)化成低的背景電導(dǎo)？1975年，美國DOWChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn）2023/2/5

R—H++NaOH

R—Na++H2OR—H++NaBr(待測物)R—Na++HBr

由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量堿轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子Br-轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸HBr，提高了檢測靈敏度。

在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用電導(dǎo)率極低的流動相溶液，例如用1×10-4～5×10-4mol/L苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2023/2/5六、空間排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，主要用于大分子的分離。凝膠滲透色譜法：以有機溶劑作流動相，多用于高分子領(lǐng)域，測定聚合物分子量分布或跟蹤聚合物合成、降解反應(yīng)。凝膠過濾色譜法：以水或水溶液為流動相，多用于生化領(lǐng)域分離天然高分子。1.分離原理基于待測物分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離

固定相：為化學(xué)惰性、具有一定孔徑的多孔凝膠（孔徑：數(shù)nm~數(shù)百nm，大于分子篩的孔徑）。2023/2/5凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，體積大的待測物分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，先后由柱中流出。2023/2/5

2.特點

（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)；

（2）保留時間短，譜峰窄，易檢測；（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。2023/2/53.固定相類型固定相流動相特點應(yīng)用軟性凝膠葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠以水溶性溶劑作流動相微孔能吸入大量的溶劑，不適宜用在HPLC用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析半剛性凝膠高交聯(lián)度的聚苯乙烯、聚乙酸酯以有機溶劑作流動相溶脹性不如軟性凝膠，用于HPLC時，流速不宜大用于大分子質(zhì)量物質(zhì)的分析剛性凝膠多孔硅膠、多孔玻璃既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相剛性大，溶脹小可在較高壓強和較高流速下操作用于大分子質(zhì)量物質(zhì)的分析2023/2/54.流動相2023/2/5§3-7高效液相色譜分離類型的選擇2023/2/51．根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，用排阻色譜法為最佳。2．根據(jù)樣品溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度。如果樣品可溶于水且能離解，采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類(如苯或異辛烷)，則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。2023/2/53．根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團。然后，確定采用什么方法合適。例如:酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液一液分配色譜。現(xiàn)列出表3-3作為選擇分離類型的參考。2023/2/5

表3-3液相色譜分離類型選擇參考表

相對分子質(zhì)量溶于水——排阻色譜，水為流動相＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品