第九章蛋白質(zhì)相互作用與定量蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)相互作用與定量

蛋白質(zhì)組學研究技術第九章蛋白質(zhì)相互作用主要研究技術酵母雙雜交技術進展TAP（TandemAffinityPurification)技術進展自動化、高通量酵母雙雜交技術和TAP技術定量蛋白質(zhì)組學研究技術主要內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)相互作用Protein-ProteinInteractions蛋白質(zhì)相互作用控制著生命過程的各個方面YeastTwoHybridMassSpectrometry二、酵母雙雜交技術及進展

YeastTwo-Hybrid，Y2H.

FieldsS.andSongO.:

Nature,1989,340:245-246研究蛋白質(zhì)相互作用的方法,利用轉(zhuǎn)錄因子組件式（modular）結(jié)構(gòu)的性質(zhì)。Y2H就是將需要研究的蛋白質(zhì)設計成“誘餌”，以釣出能與誘餌蛋白發(fā)生物理相互作用的蛋白質(zhì)（被捕食蛋白質(zhì)）。一個單轉(zhuǎn)錄因子有：

DBD:DNAbindingdomainDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

AD:Activationdomain,轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：能激活RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄。

誘餌蛋白B+DBD:不能起始轉(zhuǎn)錄被捕食蛋白的ORF+AD:不能起始轉(zhuǎn)錄。當誘餌蛋白和被捕食蛋白在同一細胞中表達，如發(fā)生相互作用，RNA聚合酶將啟動報告基因His3轉(zhuǎn)錄，合成組氨酸，如His3不表達，細胞不能生長。FieldsS.andSongO.

Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340:245-246

優(yōu)點：酵母細胞幾乎能表達所有生物基因。缺點：

并非所有蛋白質(zhì)能在酵母核內(nèi)正常行使功能，不正確的蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)：假陽性假陰性Y2H開始以轉(zhuǎn)錄因子Gal4為基礎，依靠招募RNA聚合酶II激活轉(zhuǎn)錄。1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III為基礎的Y2H，假陽性率更低。反向雙雜交系統(tǒng)：reversetwo-hybridsystem.

構(gòu)建反向篩選的報告基因（URA3，U合成所必需），蛋白質(zhì)互作激活報告基因表達，使細胞不能成活。分離雜交系統(tǒng)，split-hybridsystem

利用2個相互整合的報告基因。細胞質(zhì)中的雙雜交系統(tǒng)：

SOS招募系統(tǒng)：SOSrecruitmentsystem利用Ras信號傳導途徑的基本性質(zhì)：兩種蛋白相互作用，就會將hSos(人的鳥苷酸交換因子)招募到膜上，激活Ras,使酵母細胞在限制溫度下成活和增殖。其他新的雙雜交系統(tǒng)：

分離的泛素系統(tǒng)split-ubiquitinsyatem.(PNAS,1996,91:10340-10344)利用泛素的功能特點。當分別與泛素N端和C端部分融合的兩個蛋白質(zhì)相互作用時，使分離的泛素的兩部分靠近，泛素專一性的蛋白酶就會識別泛素，導致報道蛋白的解離釋放。單雜交系統(tǒng)，onehybridsystemDNA和蛋白質(zhì)間相互作用。鑒定與特定DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)。三雜交系統(tǒng)，threehybridsystem

RNA或小分子配體和蛋白質(zhì)的相互作用三者共同作用，才能激活轉(zhuǎn)錄。三、酵母雙雜交技術在蛋白質(zhì)組學中的應用Interactome互作組：全面詳盡的蛋白質(zhì)相互作用圖譜。病毒、細菌、酵母、線蟲等。T7噬菌體：首先用于大規(guī)模Y2H分析：

55個有25個相互作用。丙型肝炎病毒HCV：編碼10個成熟蛋白，有5個相互作用。

釀酒酵母：6000多個ORF,1996完成基因組計劃，陣列篩選法得到281個相互作用；文庫篩選法得到692個相互作用：Uetz,P.etal.,Nature,2000,403:623-627.線蟲：148個相互作用：

WalhoutA.J.etal.:

Science,2000,287:116-122.四、噬菌體展示技術

（Phagedisplay）

噬菌體展示技術是利用噬菌體的外殼蛋白與目的蛋白或多肽融合表達，將目的蛋白表達在噬菌體顆粒的外部，在蛋白質(zhì)水平上進行“Biopanning”體外篩選，十分適用于酶與其配體或抑制劑、抗原決定簇、細胞表面受體的篩選等等。這個篩選的過程很簡單，將目標肽或蛋白質(zhì)固定于平板上，鋪上噬菌體，噬菌體外殼融合蛋白與目標肽結(jié)合，不能結(jié)合的噬菌體顆粒將被洗掉，再將結(jié)合的噬菌體洗下，進行擴增培養(yǎng)，再進行一到兩次的輪回，就能夠分離到特定的噬菌體顆粒。

噬菌體展示技術（Phagedisplay）·

Ph.D.-7PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-12PhageDisplayPeptideLibraryKit·

Ph.D.-C7CPhageDisplayPeptideLibraryKit·Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem五、表面等離子體共振技術SPR

SurfacePlasmonResonance

研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。如瑞典BIACORE的單元蛋白質(zhì)芯片。將誘餌蛋白作為配基，固化在幾十納迷厚的金屬膜表面，加入含獵物蛋白的溶液，如有相互作用會特異性結(jié)合形成蛋白質(zhì)復合物，使金屬膜與溶液界面的折射率上升，導致共振角度改變。特點：快速、安全，不需標記物和染料，還可檢測蛋白-核酸及其它分子間的相互作用。

SPRDNA生物傳感器可用于基因突變的檢測、PCR產(chǎn)物測定、病毒檢測等。六、蛋白質(zhì)間連鎖圖的建立已建立釀酒酵母1548個蛋白質(zhì)間2358個相互作用網(wǎng)絡:Fields,S.Lab:

Nat.Biotechnology2000,18:1257-1261.七、酵母雙雜交技術方法首先是選擇適當?shù)妮d體系統(tǒng)：

BD,AD載體：Gal4,LexA系統(tǒng)，多已商業(yè)化。然后將待鑒定的蛋白分別構(gòu)建到載體上。

篩選文庫的雙雜交實驗流程。陣列篩選法：用不同結(jié)合型（a,α）的表達“獵物”和“誘餌”蛋白的酵母菌株一一結(jié)合，可推測已知的蛋白質(zhì)間的相互作用。文庫篩選法：用表達一種“誘餌”蛋白的酵母細胞和一個表達復雜的文庫“獵物”蛋白的酵母細胞直接結(jié)合?？砂l(fā)現(xiàn)未知蛋白。八、雙雜交系統(tǒng)及其應用主要商業(yè)公司：APPLIEDBIOSYSTEMSBIOSIGNALPACKARDINC.CLONTECHINVITROGENORIGENETECHNOLOGIESINC.PROMEGACORPQBIOGENESTRATAGENEClontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌基因的擴增和表達載體的構(gòu)建誘餌表達載體轉(zhuǎn)化到酵母中,驗證對酵母的毒性和自激活實驗獵物文庫的選擇(預轉(zhuǎn)化的文庫和預制的文庫),文庫擴增,質(zhì)粒提取誘餌和獵物用共轉(zhuǎn)化或交配(Mating)的方法轉(zhuǎn)化到同一酵母中涂布到約50個篩選平板上菌落長出后，挑取陽性菌落作beta-gal報道基因?qū)嶒灳銹CR擴增獵物基因，測序Blast分析得到獵物基因序列陽性相互作用的重新驗證(Co-IP,pull-down,共定位等功能實驗）從事大規(guī)模酵母雙雜交的研究機構(gòu)AllianceforCellSignalingMyriadGeneticsInc.HybrigenicsCuragenProteinComplexBacteriaRainJ.C.,etal.Theprotein-proteininteractionmapofHelicobacterpylori.Nature409,211-215(2001)幽門螺旋菌（導致胃?。㎡rganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownS.cerevisiae(~6000ORFs)ProteinarraysPoolsofprey192×proteomeproteome×proteome281692109S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey430assaysofpools96×9617512S.cerevisiae(~6000ORFs)Poolsofbaitsandprey3844assaysofpools96×96841105S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening15×proteome1703S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening11×proteome11334S.cerevisiae(~6000ORFs)Libraryscreening68×proteome191128YeastViralgenomeOrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownVacciniavrius(~266ORFs)Proteinarrayproteome×proteome379HCV(10ORFs)ProteinarrayLibraryscreening10×proteome22fragments×proteome0522T7LibraryscreeningRandom×Random254McCraithS.,etal.Genome-wideanalysisofvacciniavirusprotein-proteininteractions.Proc.Natl.Acad.Sci.97,4879-4884(2000)FlajoletM.,etal.AgenomicapproachofthehepatitisCvirusgeneratesaproteininteractionmap.Gene242,369-379(2000)BartelP.,etal.AproteinlinkagemapofEscherichiacolibacteriophageT7.NatureGenetics12,72-77(1996)Caenorhabditiselegans線蟲OrganismTechnologyNumberofassays(bait×prey)DetectedinteractionsAlreadyknownC.elegans(~20000ORFs)ProteinarrayLibraryscreeing29×2927×proteome812463WalhoutA.J.M.,etal.ProteininteractionmappinginC.elegansusingproteinsinvolvedinvulvaldevelopment.

Science287,116-122(2000).九、TAP（TandemAffinityPurification)技術進展NATUREBIOTECHNOLOGYVOL17OCTOBER1999特點：高純度一次實驗可以鑒定多個組分體內(nèi)純化復合體材料需要量少花費低、時間少靶蛋白可能含有TEV蛋白酶切位點EGTA可能影響復合體的穩(wěn)定Nature,415:141-147,January,2002十、自動化、高通量酵母雙雜交技術和TAP技術HyNet?:YeastTwo-HybridStrategyHySpec?:ProteinScienceandMassSpectrometryBioinformaticsAnalysisMyriadGeneticsInc.Myriad,Hitachi,Oracle&FriedliJoinForcesToMapTheEntireHumanProteome

$185MillionCollaborationtoDetermineAllHumanProteinInteractionsAndDecipherBiochemicalPathwaysAutomatedPlatingandColonyPickingLiquidmatingandplating

PickingToolRetrievingaColony

InoculatingaPlateofLiquidCulture

AutomatedPCRsetupandSequenceAnalysis

HighThroughputPCRofORFsGateway?CloningandCloneArchiveHumancelllysatepreparationGenedeliveryBacterialExpressionProteinPurificationProteinPulldownsMultidimensionalchromatographyseparationCombinedESI-MSandMALDI-MS在藥物開發(fā)中的應用AwardedUSPatentonp10TumorSuppressorGeneCholesterolDisordersRepresentNovelDrugTargetsDiscoversNovelHepatitis'C'TargetDiscoversHighCholesterolGeneNovelDrugTargetforColorectalCancerNovelDrugTargetforHepatitisBNovelProstate（前列腺）CancerGeneMajorCauseofHereditaryObesityMajorDepression（抑郁）Gene

Automatedyeasttwohybrid

screening100,000clonesperdayArrayformatFulldatatrackingMegaMate－Genetix十一、定量蛋白質(zhì)組學研究技術

QuantitativeproteomicsMannM.:Nat.biotechnol.,1999,17:954-955.

把一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進行精確的定量和鑒定的一門科學。（TrendsBiotechnol.,1999,17:121-127）

蛋白質(zhì)染色強度：定量要求：染色強度與蛋白質(zhì)量成正比；通用性好（不同蛋白質(zhì)具有相同染色能力）高靈敏度染色不影響后續(xù)鑒定（如不影響MS

中蛋白質(zhì)分子的離子化過程）定量蛋白質(zhì)組學方法：多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術蛋白質(zhì)熒光染色技術同位素標記技術同位素親和標簽技術蛋白質(zhì)芯片技術1、熒光染色定量技術有兩種染料：

共價結(jié)合：花青染料

多位點結(jié)合，蛋白質(zhì)溶解度降低，用量少，靈敏度低。

非共價結(jié)合：（1）與蛋白質(zhì)沒有特定的親和力，在疏水性環(huán)境中才產(chǎn)生熒光：如苯乙烯基染料：

SyproOrange,SyproRed,SyproRuby…

尼羅河紅：NileRed.

（2）與蛋白質(zhì)有特定的親和力

RuBPS：一種釕螯合劑。Amersham:

2-DDIGE:FluorescenceTwo-dimensionalDifferentialGelElectrophoresis熒光雙向差示凝膠電泳技術。利用與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的染料。

Proteomics,2001,1:377-396.2、采用同位素編碼親和標簽技術

IsotopeCodedAffinityTags,ICAT:

Gygietal:

Nat.Biotechnol.,1999,17:994-999.關鍵：ICTA試劑:三部分組成?？啥糠治觯旱鞍踪|(zhì)標記酶切親和色譜分離MS信號強度定量測序。3、穩(wěn)定同位素代謝標記技術

Odaetal.,PNAS,1999,96:6591-6596.方法：兩組酵母細胞：14N99.6%+15N0.4%

15N>96%(Mr大).2-D、染色找出差異蛋白，酶解后進行MALDI-TOF-MS分析：精確定量。缺點（1）只適合于微生物（2）同位素影響微生物生長與蛋白合成（3）同位素標記Mr增加，加大數(shù)據(jù)檢索難度。4、蛋白質(zhì)芯片技術將蛋白質(zhì)組的部分或全部蛋白質(zhì)種類制作成蛋白質(zhì)芯片（誘餌蛋白，如抗體）,這樣的芯片可以用于篩選特定分子的相互作用分子。實質(zhì)上是大規(guī)模的ELISA技術。技術關鍵：（1）空間上固定能辨別單一蛋白成分的分子。（2）檢測混合物中單個蛋白與它們相應的識別分子間的相互作用。類型：玻璃板芯片

3D膠芯片（3Dgelpadchip）微孔芯片（micro-wellchip）Ciphergen公司：

ProtenChip?

蛋白質(zhì)芯片Clontech?抗體芯片AbMicroarray380AbMicroarray芯片上的抗體包含針對信號傳導、癌癥、細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學等廣泛的生物功能的相關蛋白，跨度大、適用范圍廣,在毒性實驗、疾病研究和藥物開發(fā)上有廣泛的應用前景。液體蛋白芯片系統(tǒng)：傳統(tǒng)芯片技術分子間固相-液相相互作用LIQUIDCHIP分子間在液相中相互作用(分子間相互作用的最有效方式)

LiquichipSystem是在xMAP技術的基礎上建立起來的蛋白質(zhì)分析平臺。反應在懸浮于液體中的球形基質(zhì)上進行，提供了在一次樣品分析中同時進行多達100種不同的分析的可能性。使用LiquichipSystem可以完成蛋白組學研究和藥物研發(fā)中的許多種蛋白質(zhì)分析。整個系統(tǒng)包括儀器，軟件，球形反應基質(zhì)和檢測試劑。TheLiquichipTMProtein

SuspensionArraySystem液體蛋白芯片系統(tǒng)LiquichipSystem的應用免疫分析(e.g.,ELISA)酶分析受體-配基分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-核酸十二、免役共沉淀技術

檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間物理作用的方法。使用抗體時即為免役共沉淀。

基本方法：利用蛋白質(zhì)間特異親和的原理。細胞裂解在非變形條件下制備總蛋白，以一種蛋白的抗體特異地免疫沉淀這種蛋白，然后用第二種蛋白或更多種蛋白的抗體做免疫印跡，檢測它們是否被第一種蛋白共沉淀，以對照檢測相互作用的特異性。1、檢測蛋白質(zhì)的存在

Westernblot檢測參與免役共沉淀的蛋白質(zhì)的表達或存在。2、制備總蛋白提取物3、相互作用特異性對照實驗4、免役共沉淀技術的其他分析靈敏度高、能反映體內(nèi)的相互作用情況，可與Y2H結(jié)合使用。

兩個方向分別共沉淀：以蛋白A的抗體免役共沉淀，以蛋白B的抗體免疫檢測；同時以蛋白B的抗體免役共沉淀，以蛋白A的抗體免疫檢測。十三、細胞共定位技術

1、熒光蛋白融合技術

Gre