第6章 凝膠過濾

第六章凝膠過濾GelFiltration概述凝膠過濾又稱分子篩或稱體積排阻層析。根據(jù)溶質(zhì)分子量的大小而分離的一種液相層析技術(shù)。其特點是:（1）填料是具有一定范圍的篩孔尺寸的凝膠，被分離物按分子量的差異在流動相的推動下,大分子被凝膠的篩孔排阻而先流出層析柱，小分子在孔中擴(kuò)散而后流出。（2）被分離物不與填料發(fā)生任何化學(xué)結(jié)合；降低了因不可逆結(jié)合而引起的蛋白質(zhì)的損失和失活。（3）快速純化生物大分子，并在第一洗脫峰中，雜質(zhì)流于柱中。凝膠過濾的發(fā)展理論與技術(shù)的發(fā)展1951.Kosikowrky用淀粉柱子分離蛋白質(zhì)中的氨基酸；1955.Lundyuist，Storgaras在淀粉柱上按組分的分子量大小分離，提出排阻層析的概念；1956.Puthven在淀粉柱上估計了分子量。載體材料的發(fā)展1959.Rovath,Flodin合成了葡聚糖（Sephadex）凝膠；1962.Hierten,Mosbach合成聚丙烯酰胺凝膠（Polyacrylamidebiogels）;1964.Hierten合成瓊脂糖球形凝膠（Spheriealagarose）1976.Regnier合成甘油丙基多孔玻璃（Glycerlpropyl）內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第一節(jié)凝膠的分類及其性質(zhì)所用的填料或載體通稱凝膠；凝膠過濾層析中的填料產(chǎn)品較多，為了分辨純化效果及分離樣品的活性保存，對填料（載體或介質(zhì)）的選擇、層析條件的確定是首要考慮因素。凝膠篩孔的尺寸大小、凝膠顆粒的大小、均勻性、機(jī)械強度及化學(xué)穩(wěn)定性均是凝膠層析的基本性質(zhì)。

凝膠層析中常用凝膠包括5個主要類型，即：葡聚糖凝膠(dextrangel商品名Sephadex)瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharosegel)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel，商品名為Bio—GelP)Sephacryl由瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠(商品名為Superdex）一、葡聚糖凝膠SephadexG-型性質(zhì)：1.親水性：在水中易膨脹；2.交聯(lián)度的型號豐富適應(yīng)各種分子量范圍的分級分離；3.穩(wěn)定性：對強酸、氧化劑敏感。4.吸附性：凝膠含少量的羧基基團(tuán)能與堿性蛋白質(zhì)的電荷基團(tuán)發(fā)生吸附，在純化及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時有影響；可用中性鹽0.05MNaCl洗脫克服。

結(jié)構(gòu)：右旋糖酐G型與交聯(lián)劑3－氯－1,2－環(huán)氧丙烷以醚鍵交聯(lián)而成。二、瓊脂糖凝膠SepharoseSepharose6B,4B,2B;由D-半乳糖和3，6脫水的L-半乳糖合成的球形結(jié)構(gòu)。其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由糖鏈間的次級氫鍵起穩(wěn)定作用。由瓊脂糖的濃度控制網(wǎng)孔的疏密和大小。分離范圍1×104－5×107。ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity1995SepharoseCL(瓊脂糖凝膠)Sepharose與2、3－二溴丙醇反應(yīng)形成交聯(lián)瓊脂糖。（SepharoseCL）其化學(xué)、物理的穩(wěn)定性提高；機(jī)械強度增強；適用pH范圍更寬。分離范圍1×104－5×107。Bio-Gel A 三、聚丙烯酰胺凝膠Bio－GelP

丙烯酰胺用甲撐雙丙烯酰胺交聯(lián)成球形的聚丙烯酰胺的親水性干凝膠。特性:對酸、堿的穩(wěn)定性較弱，強酸、強堿引起酰胺基脫水。工作的pH范圍2－10，在有SDS、鹽酸胍、尿素、20％乙醇溶液中可安全使用。分離蛋白質(zhì)分子量范圍800-1.5×105。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度(按球蛋白和肽計算)。四、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)成。其物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，工作的pH范圍2－11；可用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖、蛋白聚糖的分離。分離范圍1000－1×107。五、Superdex高交聯(lián)度的瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合的分子篩。具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；廣泛的pH工作范圍；對SDS、尿素、鹽酸胍等不敏感；并不影響分離效果。既具有瓊脂糖凝膠的特性；又具有葡聚糖凝膠的特性，是Pharmacia公司推出的新一代凝膠產(chǎn)品，適合于精細(xì)層析分離。目前分辨率、選擇性最高的凝膠過濾介質(zhì)，流速快而反壓低。Superdex30<10,000Superdex753000-70,000Superdex20010,000-600,000內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第二節(jié)基本原理基質(zhì)具有立體網(wǎng)狀篩孔結(jié)構(gòu)。依據(jù)交聯(lián)度不同，孔徑的大小按不同的型號區(qū)分，而對某一種基質(zhì)其孔徑一致；當(dāng)分離物足夠大而完全排阻，不進(jìn)入凝膠，隨著外水體積（Vo）洗脫流出；或完全不排阻，洗脫時在凝膠的篩孔中自由滲透、擴(kuò)散；物質(zhì)在凝膠柱層析中被排阻的范圍在0～100％之間的為部分排阻或不完全排阻。床體積Vt、內(nèi)水體積Vi、外水體積Vo

與分配系數(shù)Kav之間的關(guān)系任何一種分離物在凝膠層析柱中被排阻的范圍在0～100％之間，用排阻系數(shù)Kav表示。Kav的大小依賴凝膠床體積Vt，外水體積Vo及分離物本身的洗脫體積Ve。見公式：Vt=Vo+Vi+Vg當(dāng)Vt、Vo確定后，Ve是隨著分離物的分子質(zhì)量的變化而變化，分子量愈大，Kav值愈??；反之亦然。依據(jù)公式Kav值在0～1之間變化Kav=Ve-VoVt-VoVt與Vo是定值，Ve隨被分離的分子量變化而變化。Ve-VoVi+VgVt=Vo+Vi+VgVg忽略時,Kav＝Vt=Vo+Vi或Vt-Vo=ViVe-VoVi=KavVe=Vo;Kav=0.Ve=Vo+Vi=VtKav=1,

當(dāng)0﹤Kav﹤1：Ve=Vo+Kav*Vi,表示內(nèi)水體積只有一部分可被組分利用擴(kuò)散，其Ve在Vo與Vo+Vi之間變化。Kav﹥1,凝膠有吸附作用，Ve﹥Vo+Vi。帶入上式，有Kav可以有下列幾種情況：(1)當(dāng)Kav=O時，則Ve=Vo，即對于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)(全排阻)，洗脫容積等于空隙容積(組分I)。(2)當(dāng)Kav=1時，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫容積應(yīng)為空隙容積與內(nèi)容積之和(組分Ⅲ)。(3)當(dāng)0<Kav<1時，Ve=Vo+Kav*Vi。表示內(nèi)容積只有一部分可被組分利用，擴(kuò)散滲入，Ve即在Vo與Vo+Vi之間變化(組分Ⅱ)。(4)有時Kav>1，表示凝膠對組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vi，例如一些芳香族化合物的洗脫容積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值，這些化合物的Kav>1，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在SephadexG一25中的Kav值分別為1.2，1.4和2.2。

層析柱中各物質(zhì)發(fā)生連續(xù)地排阻與擴(kuò)散效應(yīng)，結(jié)果是：大分子量物質(zhì)首先出來，再依分子量大小次序隨后洗脫出。因此，Kav值的差異影響分離效果，Kav值的差異性大，分離效果好，Kav值的差異性小，分離效果差。不同上樣體積時洗脫體積的測定A：加樣體積極小時，洗脫體積Ve從樣品入柱開始－洗脫峰的最大處止。B:加樣體積中量時，洗脫體積Ve從樣品入柱1/2時－洗脫峰的最大處止。C：加樣體積特大時，洗脫體積Ve從樣品入柱開始－洗脫峰出現(xiàn)止。VeVeVe原理小節(jié)Kav=0Ve=Vo

完全排阻Kav=1Ve=Vt

完全不排阻Kav=0~1之間

部分排阻Kav﹥1Ve﹥Vt

吸附現(xiàn)象

用凝膠過濾層析，溶質(zhì)和凝膠表面之間沒有任何相互作用時，體積排阻層析才能嚴(yán)格按照分子量大小進(jìn)行分離；特殊分離效果與分子的結(jié)構(gòu)、形狀密切相關(guān)。

例：SephadexG－50分離范圍＝1500～30000，表示小于1500時，Kav=1；大于或等于30000時，Kav＝0；當(dāng)M.W＝20000時，方法：1）測量洗脫體積；2）經(jīng)過計算得出Kav＝0.67，故可以將上述三者分開。問M.W為5萬和7萬的蛋白質(zhì)，可否分開？為什么？內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第三節(jié)操作一、凝膠的選擇與處理凝膠的選擇；凝膠的處理；凝膠用量的計算型號選擇粒度克＝

Лrh膨脹度（床體積／克干重）21.漂去破、碎的凝膠；2.凝膠的充分溶脹，沸水浴或真空泵抽氣。凝膠顆粒大小對分辨率的影響

分辨率：粗顆粒劣于細(xì)顆粒；更劣于超細(xì)顆粒。核苷酸在不同大小凝膠顆粒中的洗脫圖譜

二、凝膠柱的制備柱子的選擇；柱子的填裝；柱子的鑒定平衡柱子直徑與長度比例、流速與分辨率的關(guān)系加樣量與洗脫峰及分辨率的關(guān)系三、加樣與洗脫加樣洗脫加樣量的控制原則定性目的：依據(jù)檢測器的靈敏度確定，紫外檢測蛋白質(zhì)，加樣量為Vt的1％～5％。（凝膠過濾會將樣品稀釋2～3倍），須對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s。制備與脫鹽：在不影響分辨率時，盡量加大樣品體積，可達(dá)床體積的20～30％；加樣量根據(jù)分配系數(shù)Kav或洗脫體積Ve確定。ABVeAVeBA、B兩洗脫物體積之差為分離體積Vs，Vs=VeA-VeB，當(dāng)樣品體積Vp≤Vs時，二者分開。所以Vs,Vp，便可分開。樣品粘度與洗脫曲線、分辨率的關(guān)系洗脫與繪制洗脫曲線洗脫液的組成簡單：主要是洗脫液能溶解被洗脫物并不使其變性或失活。一般選用單一的緩沖液，若無非特異性吸附，離子強度為0.05M的中性鹽；或用蒸餾水洗脫。洗脫流速恒定：用操作壓、恒流泵及限制閥進(jìn)行調(diào)節(jié)；或用恒壓瓶、調(diào)節(jié)層析柱的進(jìn)口與出口的兩液面高度，使水壓恒定，均勻，利于Kav值穩(wěn)定，提高分離效果。安全裝柱的注意保證柱子不會脫水保持水壓高度一致，柱壓穩(wěn)定裝柱子的操作圖示凝膠的處理凝膠的填裝柱子型號的選擇層析系統(tǒng)的接通與平衡柱子的檢測與樣品的加入四、凝膠柱的保養(yǎng)和凝膠的保存

交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，適宜于微生物的生長。因此染菌后的凝膠會改變層析特性，影響效果。(1)經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為宜。濕態(tài)保存常用的抑菌劑有0.02％疊氮鈉、0.002％洗必太、0.1mol／L氫氧化鈉等。(2)較長時期不使用的凝膠可采用干燥保存法。內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第四節(jié)應(yīng)用一、脫鹽和濃縮二、分離生物大分子物質(zhì)三、去熱源物質(zhì)四、測定蛋白質(zhì)的分子量一、脫鹽與濃縮利用鹽類小分子物質(zhì)可以在凝膠的篩孔中自由擴(kuò)散，而大分子物質(zhì)被排阻在其外的原理，選擇凝膠SephadexG-25（700－8000）將小分子鹽有效地除去。比透析方法更加溫和，速度快，不引起生物大分子的變性。對鹽析樣品的后處理非常適用。凝膠具有吸水的性質(zhì)，可將透析袋內(nèi)的稀樣品進(jìn)行濃縮。蛋白質(zhì)的脫鹽和濃縮二、分離生物樣品某些理化性質(zhì)相近（溶解度、電荷性），分子量不同，或聚合體不等的混合樣品，其他方法難以奏效時，凝膠過濾方法便適用。用加工修飾的凝膠純化糖鏈分子、膜蛋白、抗原、抗體、分離重組蛋白，包涵體蛋白、肽類、核酸、病毒以及寡核苷酸等。分離病毒：

根據(jù)顆粒的大小將不同的病毒分別洗脫＞30nm＞20nm三、去除熱源（內(nèi)毒素）物質(zhì)熱源又稱內(nèi)毒素，是含脂肪A、糖類和蛋白，帶負(fù)電荷的復(fù)合大分子。由于是制備藥品工藝中難以克服的問題，經(jīng)常引起臨床的安全。可利用凝膠排阻原理，將熱源物質(zhì)從藥品中排除。四、用凝膠過濾方法測定蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)凝膠層析的原理，對同一類型物質(zhì)的洗脫特征與組分的分子量有關(guān)。流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，分子量大的走在前面。洗脫體積Ve是該物質(zhì)分子量對數(shù)的線性函數(shù)，可用下式表示：Kav=-blgMr+c式中，b與c為常數(shù)，Mr為分子量。通常多以Kav對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”，曲線的斜率說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。

依據(jù)球形蛋白質(zhì)分子的大小、洗脫體積、速率的差異將各自分開，以標(biāo)準(zhǔn)分子制作的洗脫曲線，以其Ve及Kav值判斷測定樣品的分子量。圖示12400－67000的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的㏒M、Kav的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

0.20.40.60.8KavLogM4.84.