第三章微生物生態(tài)學(xué)基本研究方法

第三章：微生物生態(tài)學(xué)的基本研究方法2023/2/51參考書陳聲明，林海萍，張立欽主編，微生物生態(tài)學(xué)導(dǎo)論，高等教育出版社，2007池振明主編，2005，現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)，科學(xué)出版社楊家新主編，2004，微生物生態(tài)學(xué)，化學(xué)工業(yè)出版社宋福強(qiáng)主編，2008，化學(xué)工業(yè)出版社張素琴著：2005，科學(xué)出版社MolecularMicrobialEcology,

A.MarkOsborn&CindyJ.Smith,

Taylor&FrancisGroup,20052023/2/522023/2/53專業(yè)期刊MicrobialEcologyAppliedandenvironmentalmicrobiologyAdvancesinmicrobialecologyISMEJournalAppliedMicrobiologyandBiotechnologyFEMSMicrobiologyEcologyFrontiersinMicrobiologyGeomicrobiologyJournalNatureMicrobiologyReview2023/2/54你們能夠想到什么方法開展微生物生態(tài)學(xué)的研究？微生物生態(tài)學(xué)？研究微生物與其周圍生物和非生物環(huán)境之間相互關(guān)系的一門學(xué)科關(guān)注的內(nèi)容：主要研究微生物的分布、種群組成、數(shù)量和活力等與環(huán)境的關(guān)系，以及微生物之間、微生物與高等有機(jī)體之間的相互關(guān)系。2023/2/551、經(jīng)典技術(shù)和方法直接觀察測定培養(yǎng)研究2、生理生化方法3、分子生物學(xué)方法4、穩(wěn)定同位素方法2023/2/561、經(jīng)典技術(shù)和方法——直接觀察測定利用顯微鏡對樣品中的微生物直接觀察計(jì)算數(shù)目，測定絲狀微生物長度（普通染色、熒光染色）優(yōu)點(diǎn)：直接觀察天然樣品中微生物的形態(tài)和微生物所處的位置缺點(diǎn)：樣品量少，代表性差2023/2/57HepG2CellsStainedUsingtheLIVE/DEAD?CellImagingKit,showinggreen-fluorescentlivecellsandred-fluorescentdead

cells.HeLacellsshowingnegativestainingbyICC/IFusingonlysecondaryantibody.Thecellswere100%methanolfixed(5min)andthenincubatedin1%BSA/10%normalgoatserum/0.3Mglycinein0.1%PBS-Tweenfor1htopermeabilisethecellsandblocknon-specificprotein-proteininteractions.Thesecondaryantibody(red)wasab150091AlexaFluor?647goatanti-rabbitIgG(Fc)usedat2μg/mlfor1h.DAPIwasusedtostainthecellnuclei(blue)ataconcentrationof1.43μM.2023/2/582023/2/59Archaeainthepictureinred,sulfatereducingBacteriaingreen.Credit:AnneliePernthaler/UFZFISH技術(shù)2023/2/5101、經(jīng)典技術(shù)和方法——培養(yǎng)研究對采集的樣品進(jìn)行稀釋、培養(yǎng)辨認(rèn)培養(yǎng)物的種類2023/2/5112023/2/512（1）基內(nèi)菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起；（2）菌落邊緣有輻射的菌絲，稱為輻射狀菌絲；（3）生長后期表面形成緊密的絨毛狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、不透明、多皺的表面，上面常有一層色彩鮮艷的干粉；（4）可形成絮狀或顆粒狀的典型菌落，菌落的正反面顏色往往不一致，菌落邊緣培養(yǎng)基的平面有變形現(xiàn)象；（5）有特殊氣味（土霉氣味）等。2023/2/5132023/2/5142023/2/515細(xì)菌菌落2023/2/5161、經(jīng)典技術(shù)和方法——培養(yǎng)研究優(yōu)點(diǎn)：能對活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，并能區(qū)分真菌、放線菌和細(xì)菌缺點(diǎn)：可培養(yǎng)率很低<1%;單菌落是否由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來；絲狀微生物菌落究竟是由孢子而來還是由菌絲而來難以區(qū)分2023/2/517經(jīng)典的觀察和培養(yǎng)方法能夠在一定程度上告訴我們樣品中微生物的數(shù)量、可培養(yǎng)微生物的數(shù)量及類型。但這些結(jié)果不能告訴我們微生物在樣品中能干什么？2023/2/518包括用于微生物生物量測定的氯仿熏蒸方法、底物誘導(dǎo)呼吸法和光合微生物色素法等；用于測定土壤C礦化速率和微生物呼吸強(qiáng)度等方法；用于測定土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物活性和酶活性的分析方法；測定微生物能量代謝的分析方法等2、生理生化方法2023/2/519代謝活力研究：放射性/穩(wěn)定同位素標(biāo)記記某種代謝物，測定代謝活力C14，C13，H3，N15酶活性測定ATP含量測定：ATP僅存在于活的細(xì)胞中，且在細(xì)胞中的含量基本一致ATP檢測儀2023/2/520代謝活力研究葉綠素含量測定：估計(jì)藻類和光合細(xì)菌的生物量和代謝活力土壤呼吸速率測定：間接估計(jì)土壤中的生物量，不適于僅有厭氧呼吸或發(fā)酵的微生物測定土壤呼吸測定儀2023/2/521代謝活力研究優(yōu)點(diǎn)：能確定樣品中微生物能做什么；缺點(diǎn)：無法說明樣品究竟是哪些微生物在起作用，樣品存在哪些微生物種類和微生物在自然樣品中的分布情況2023/2/522Biolog微平板法PLFA圖譜分析2023/2/523Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)是美國Biolog公司從1989年開始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng)，最早進(jìn)入商品化應(yīng)用的是G-好氧細(xì)菌鑒定數(shù)據(jù)庫(GN),其后陸續(xù)推出G+好氧細(xì)菌(GP)、酵母菌(YT)、厭氧細(xì)菌(AN)和絲狀真菌(FF)鑒定數(shù)據(jù)庫。Biolog系統(tǒng)6101版數(shù)據(jù)庫共包括1973種微生物，其中細(xì)菌234個(gè)屬，1226個(gè)種，與其他鑒定系統(tǒng)相比，其微生物種類的數(shù)據(jù)量較大，適合于環(huán)境、食品、工業(yè)、臨床和動(dòng)植物病原菌的鑒定分析。BIOLOG微平板法2023/2/524Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定。細(xì)菌利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí),會將四唑類氧化還原染色劑(TV)

從無色還原成紫色，從而在鑒定微平板上形成該菌株特征性的反應(yīng)模式或“指紋圖譜”。通過纖維光學(xué)讀取設(shè)備——讀數(shù)儀來讀取顏色變化,由計(jì)算機(jī)通過概率最大模擬法將該反應(yīng)模式或“指紋圖譜”與數(shù)據(jù)庫相比較，將目標(biāo)菌株與數(shù)據(jù)庫相關(guān)菌株的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲得最大限度的匹配,可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析的菌株的屬名或種名。2023/2/525BIOLOGECO微平板含3組相同的碳源，根據(jù)平均顏色變化情況，計(jì)算微生物群落的多樣性指數(shù)、代謝特征的變化等。2023/2/5262023/2/527四氯唑染料96孔微孔板2023/2/528培養(yǎng)時(shí)間(h)淺層含水層沉積物中微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD的變化2023/2/529趙銳等，20102023/2/530趙銳等，20102023/2/531趙銳等，20102023/2/532磷脂類化合物只存在于細(xì)胞膜中，不同微生物其磷脂脂肪酸組成和含量都不相同。一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化合物馬上降解。因此該方法十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。PLFA圖譜分析2023/2/533細(xì)胞膜磷脂雙分子層2023/2/534毛細(xì)管柱2023/2/535TypicalGC-FIDsignalofextractedPLFAsunder(a)landfillgasddition(W+LG)and(b)thecontroltreatment(W,greycolourintheenlargement)in20cmsoildepth.(1)i14:0,(2)14:0,(3)i15:0,(4)a15:0,(5)15:0,(6)i16:0,(7)16:1o8c,(8)16:1o7c,(9)16:1o6c,(10)16:1o5c,(11)16:0,(12)10Me16:0,(13)i17:0,(14)a17:0,(15)17:1o8c,(16)cy17:0,(17)17:0,(18)10Me17:0,(19)18:2o6,9,(20)18:1o9c,(21)18:1o8c,(22)18:1o7c,(23)18:0,(24)cy19:0,(IS)internalstandard19:0.Watzingeretal.,2008,SoilBiology&Biochemistry40(2008)751–7622023/2/5363、分子生物學(xué)2023/2/5373、分子生物學(xué)方法(G+C)摩爾百分含量核酸探針雜交技術(shù)DNA-DNA雜交DNA序列分析基因芯片宏基因組學(xué)基于PCR的指紋圖譜分析2023/2/5382023/2/539周繼中Oklahoma2023/2/5403、分子生物學(xué)方法基于PCR的指紋圖譜分析DGGE/TGGE單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）技術(shù)RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技術(shù)限制性片段多態(tài)性（RFLP:restrictionfragmentlengthpolymorphism）/擴(kuò)增性cDNA限制性酶切片段分析（ARDRA:amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis）末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)核糖體基因間隔序列分析（RISA:ribosomalintergenicspaceranalysis）/自動(dòng)核糖體基因間隔序列分析（ARISA）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）高度重復(fù)序列或微衛(wèi)星區(qū)域2023/2/5412023/2/542穩(wěn)定性同位素探針(stableisotopeprobing,簡稱SIP)要先將標(biāo)記的底物13C(或15N)添加到系統(tǒng)中,然后再提取微生物群落DNA，用梯度離心法把重的DNA(被13C或15N標(biāo)記)和輕的DNA(未被13C或15N標(biāo)記)分開。用群落DNA分析方法分別對重DNA和輕DNA進(jìn)行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,從而知道哪些微生物在起作用。SIP技術(shù)非常明顯的優(yōu)點(diǎn)是可以明確群落中實(shí)際起作用的微生物,但也有一些缺點(diǎn)。如不易檢測數(shù)量很少但活性很高的微生物的活性;鑒于DNA中要求N的含量相對較低，SIP技術(shù)比較適合研究與碳素轉(zhuǎn)化有關(guān)的活性微生物群落。4、穩(wěn)定同位素?方法2023/2/543什么是微生物生態(tài)學(xué)？微生物生態(tài)學(xué)的研究方法有哪些？每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？舉例說明上節(jié)內(nèi)容回顧2015.12.12023/2/5442023/2/545基本知識氨氧化NH3+→NO2-→NO3-硝化作用

amoA（功能基因）氨氧化細(xì)菌（AOB）,氨氧化古菌（AOA）抑制劑的使用：（1）dicyandiamide(DCD,雙氰胺)，allylthiourea（烯丙基硫脲），Nitrapyrin（三氯甲基吡啶）【對AOA和AOB均有抑制性，但對AOB的抑制作用更強(qiáng)】；

（2）karrnamycin；sulfathiazole（磺胺噻唑）抗生素類，AOB；

（3）NO-scavengercarboxy-PTIO【強(qiáng)烈抑制AOA，對AOB影響不大】二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分別擴(kuò)增PNR：potentialnitrificationrate大多數(shù)AOA屬于自養(yǎng)型，少數(shù)混養(yǎng)型2023/2/5462023/2/547文章剖析主要觀點(diǎn)：強(qiáng)酸性土壤中氨氧化古菌比氨氧化細(xì)菌對氨氧化所起的作用更重要涉及到的微生物生態(tài)學(xué)方法：分子生物學(xué)（PCR,DGGE）穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SIP）生理生化方法2023/2/548主要論據(jù)SignificantlypositivecorrelationsbetweennitrateconcentrationandamoAgeneabundanceofAOA,butnotofAOB.13CO2-DNA-stableisotopeprobingresultsshowedsignificantassimilationof13C-labeledcarbonsourceintotheamoAgeneofAOA,butnotofAOB.Additionofthenitrificationinhibitordicyandiamide(DCD,雙氰胺)completelyinhibitedthenitrificationactivityandCO2fixationbyAOA,accompaniedbydecreasingthaumarchaealamoAgeneabundance.BacterialamoAgeneabundancedecreasedinallmicrocosmsirrespectiveofDCDaddition,andmostlyshowednocorrelationwithnitrateconcentrations.2023/2/549DCD的加入能強(qiáng)烈抑制土壤中氨氧化作用的進(jìn)行.無抑制劑添加抑制劑2023/2/550DCD的加入使得AOA

amoA基因豐度減少AOAamoA拷貝數(shù)無DCD添加DCD2023/2/5