第十三章超氧化歧化酶研究進(jìn)展4-12

第十三章超氧化物歧化酶研究及應(yīng)用進(jìn)展高麗萍20010.4.12一、超氧化物歧化酶的來(lái)源、分布及種類二、超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用機(jī)理及其基因的分子生物學(xué)三、超氧化物歧化酶的活力測(cè)定和生理功能四、超氧化物歧化酶的研究動(dòng)態(tài)、開(kāi)發(fā)應(yīng)用及存在的問(wèn)題SuperoxideDismutase

簡(jiǎn)稱SOD,EC1.5.1.1含不同金屬離子的氧化還原酶廣泛存在于生物界歷史與發(fā)現(xiàn)1938年，MannheKeilin首次從牛紅細(xì)胞中分離出一種藍(lán)色的含銅蛋白。當(dāng)時(shí)并不知道它們的性質(zhì)和作用，以為它是金屬的儲(chǔ)藏庫(kù)。

1969年，Mccord和Fridovich因其能催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，而將其命名為超氧化物歧化酶。主要作用：專一地去除生物氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基。醫(yī)藥---預(yù)防或治療由超氧陰子自由基引起的多種疾病，是一種很有用途的酶。生物領(lǐng)域---抗病與抗衰老食品---功能性食品一、SOD的來(lái)源、分布及種類1、來(lái)源與分布廣泛存于生物界的金屬酶類，是生物體防御活性氧毒害的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。Keele等推測(cè)，在所有需氧細(xì)胞包括最簡(jiǎn)單的微生物體內(nèi)，都可能含有。1973年，Bell等發(fā)現(xiàn)厭氧菌硫酸還原菌中有SOD活力，以后在多種專性厭氧菌中都發(fā)現(xiàn)其存在，只是活力很低，不易檢測(cè)。侯金泉等考察發(fā)現(xiàn)蚯蚓、葡萄、大蒜及一些保健飲料中含量豐富。迄今為止，人們已從細(xì)菌、真菌、原生植物、藻類、昆蟲(chóng)、植物、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物（有氧呼吸生物體內(nèi)）中分離提純得SOD。含量最豐富的是動(dòng)物的肝臟組織、血液。含SOD較高的天然植物有大蒜，韭菜、大蔥、油菜、檸檬和番茄等也含有。微生物中SOD含量與該菌的需氧程度和耐氧能力有很大關(guān)系，一般菌體耐氧能力強(qiáng)，其SOD含量就高。真核微生物的SOD含量高于原核生物，好氧微生物顯著高于厭氧微生物。2、分類根據(jù)SOD所含金屬輔基的不同，一般可將其分為Cu/ZnSOD、MnSOD、FeSOD三種類型。Cu/ZnSOD是真核生物酶。主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的基質(zhì)中，動(dòng)物血肝、奶、植物葉、果等均含有。MnSOD和FeSOD是原核生物酶。MnSOD主要存在于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞以線粒體基質(zhì)中FeSOD主要存在于原核細(xì)胞及少數(shù)植物中。二、超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用機(jī)理及其基因的分子生物學(xué)（一）、SOD的結(jié)構(gòu)1、Cu/ZnSOD分子結(jié)構(gòu)為二聚體或四聚體，亞基分子結(jié)構(gòu)由β-折疊組成，幾乎沒(méi)有α-結(jié)構(gòu)，分子量為32000-65000。三維結(jié)構(gòu)由2個(gè)基本相似的亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基的分子量為16KD，150個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)銅原子和一個(gè)鋅原子。兩個(gè)相同亞基之間通過(guò)非共價(jià)鍵的疏水相互作用而締合，類似于圓筒的端面。2、MnSOD和FeSODMnSOD和FeSOD一般為二聚體或四聚體，每個(gè)亞基的分子量約為23KD，含0.5-1.0個(gè)Fe原子。它們?cè)诳臻g結(jié)構(gòu)上與Cu/ZnSOD不同，含有較高程度的α-螺旋，而β-折疊較少。（二）、SOD的作用底物和作用機(jī)理交聯(lián)聚合脂質(zhì)過(guò)氧化物蛋白質(zhì)導(dǎo)致膠原堅(jiān)硬、長(zhǎng)度縮短、失去膨脹力不溶性蛋白質(zhì)皺紋和老年斑是如何產(chǎn)生的？氧自由基多價(jià)不飽和脂肪酸丙二醛與磷脂酰乙醇胺交聯(lián)氧化酶黃色色素棕褐色色素與蛋白質(zhì)、胺類或脂類結(jié)合（三）、SOD的性質(zhì)1、基本性質(zhì)特征MnSOD和FeSOD性質(zhì)相似，它們與Cu/ZnSOD在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)，分子量，光譜性質(zhì)等方面差別較大。Cu/ZnSOD呈藍(lán)綠色，分子中的銅為二價(jià)，紫外、可見(jiàn)特征吸收峰在250nm、680nm。

MnSOD呈紫紅色（粉紅色），特征吸收峰在280nm、475nm。FeSOD呈褐色（黃），特征吸收峰在280nm、350nm。2、熱穩(wěn)定性對(duì)熱表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性。在55℃/15~30分鐘，60℃/10~25分鐘或65℃/10~15分鐘的條件下，酶活性的變化不大。加熱至75℃時(shí)，其酶活性幾乎不會(huì)喪失。在離子強(qiáng)度非常低時(shí)，即使加熱至95℃其酶活性喪失亦很小。牛紅細(xì)胞中Cu-Zn-SOD的Tm為83℃室溫下保藏9個(gè)月，酶活存留率為60%；保藏一年為51.2%。SOD的熱穩(wěn)定性有種族差異，如大鼠肝中的Mn-SOD不耐熱，但人肝和雞肝的Mn-SOD卻很耐熱。3、pH的影響天然的Cu-Zn-SOD在pH3.6時(shí)，95%的Zn會(huì)脫落，pH<6.0，Cu的結(jié)合位點(diǎn)要移動(dòng)，pH>12.2時(shí)酶的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，但總的來(lái)說(shuō)，SOD對(duì)pH并不敏感，通常pH5.3～9.5范圍內(nèi)對(duì)酶活性影響不大4、對(duì)氰化物、H2O2的敏感性Cu-Zn-SOD活力受KCN、H2O2抑制Mn-SOD活力不受KCN、H2O2抑制Fe-SOD活力不受KCN、受H2O2抑制臨床診斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Mn-SOD要比正常低得多5、金屬輔因子Cu-Zn-SOD中Zn僅與酶分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，而與催化活性無(wú)關(guān)，Cu與催化活性有關(guān)，透析去Cu，酶活全部喪失，重新加入，活性恢復(fù)。Mn和Fe與Cu一樣分別對(duì)Mn-SOD和Fe-SOD的催化活性具有作用。6、變性劑和還原劑變性劑：尿素、SDS和EDTA。牛血SOD在含SDS、EDTA的6M尿素溶液加熱活性喪失，但在8M尿素溶液中相當(dāng)穩(wěn)定。還原劑：巰基乙醇導(dǎo)致酶活性的降低巰基乙醇作用于-SH或二硫鍵，當(dāng)加入后SOD就會(huì)解聚。這已在人、牛和麥胚中的Cu-Zn-SOD中得到證實(shí)。7、電離輻射電離輻射會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子，SOD能清除超氧陰離子，SOD具有抗輻射作用。SOD通過(guò)輻照后，除酶本身活性降低外，許多理化性質(zhì)如電子圖譜、紫外吸收、電子核磁共振以及銅、鋅的含量等都會(huì)改變。Mn-SOD和Fe-SOD經(jīng)電離輻射后，金屬輔助因子Mn和Fe會(huì)脫落，導(dǎo)致酶活性的喪失。(四）、SOD基因的分子生物學(xué)目前,在基因庫(kù)中已經(jīng)登記的SOD基因已有上千個(gè),來(lái)自各種微生物、動(dòng)物和植物等,并有多種SOD已經(jīng)在大腸桿菌、酵母等載體中得到表達(dá),在植物中也得到多種SOD的cDNA克隆并轉(zhuǎn)化成功了不同的植株,獲得了SOD活性增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)SOD基因種子的水培試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株能在葉綠體中過(guò)量表達(dá)FeSOD,在葉綠體和線粒體中過(guò)量表達(dá)MnSOD,其SOD活性都比沒(méi)經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)比植株高許多。三、超氧化物歧化酶的活力測(cè)定和生理功能（一）、SOD的活力測(cè)定SOD活性在糖尿病和慢性腎功能不全與正常者間有顯著差異；吸煙者紅細(xì)胞SOD含量均較非吸煙者低.可見(jiàn)，適宜的SOD活力測(cè)定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1、直接法脈沖輻射分析法，截流光譜分析法，極譜氧電極法和極譜法，可直接獲得SOD催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)信息，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中SOD濃度的變化。因受試劑和儀器的限制，此類方法一般難于在實(shí)驗(yàn)室推廣。2、間接法由于SOD的作用底物是O2ˉ，它的存在壽命很短，而上述直接法又不能得到普遍推廣，因此一般常用間接的活力測(cè)定方法。此類方法有經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法，改良的鄰苯三酚自氧化法，四氮唑藍(lán)法，腎上腺素自氧化法、聯(lián)二茴香胺法以及黃嘌呤氧化酶法，化學(xué)發(fā)光免疫法等。2、間接法原理是：有一產(chǎn)生O2-的系統(tǒng)，使O2-再產(chǎn)生一個(gè)便于檢測(cè)的反應(yīng)，通過(guò)監(jiān)測(cè)SOD對(duì)這個(gè)反應(yīng)的抑制程度，間接測(cè)定SOD活力。O2-+羥胺→亞硝酸鹽+顯色劑→紫紅色2O2-→H2O2(SOD存在時(shí))（二）、SOD的生理功能A.SOD是特殊的氧自由基清除劑B.明顯的防曬效果，可有效防止皮膚受電離損傷；C.有效防止皮膚衰老，祛斑，抗皺，起抗氧化酶的作用。D.明顯的抗炎作用，對(duì)皮膚病有一定的療效。四、超氧化物歧化酶的研究動(dòng)態(tài)、開(kāi)發(fā)應(yīng)用及存在的問(wèn)題（一）、SOD的研究動(dòng)態(tài)

1、結(jié)構(gòu)性能改造：①SOD酶半衰期短，室溫下通常只有6—10分鐘（min）；②分子量約32000道爾頓，不易透過(guò)細(xì)胞膜；③如果口服，易受蛋白酶水解而失去活力；④每人身體接受外源性SOD的差異。這些問(wèn)題往往主要通過(guò)SOD的化學(xué)修飾來(lái)解決。

SOD化學(xué)修飾的方法①對(duì)SOD的氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾,主要是對(duì)非活性部位進(jìn)行修飾,目的是提高其穩(wěn)定性同時(shí)保留較高的生物活性②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯屬烴基氧化物等)對(duì)SOD進(jìn)行共價(jià)修飾以提高酶學(xué)特性③對(duì)SOD進(jìn)行酶切改造,降低相對(duì)分子質(zhì)量、減小抗原性。研究表明:化學(xué)修飾后SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐熱、耐酸堿和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。2、SOD模擬研究——活性中心模擬謝英等人合成了以二肽為配體的銅2(N2正十二碳酰雙甘肽)配合物,這是一個(gè)帶功能基的長(zhǎng)鏈銅(Ⅱ)氨基酸配合物,同時(shí)用脈沖輻解法測(cè)定了其SOD活性,較好地模擬SOD毛宗萬(wàn)等人研究了具有Cu/Zn-SOD酶活性中心類似結(jié)構(gòu)的模型化合物,結(jié)果表明,咪唑橋N原子沿四方錐配位底面位置與Cu(Ⅱ)配位的模擬物活性大大高于咪唑橋N原子沿四方錐軸向與Cu(Ⅱ)配位的模擬物-----SOD模擬物具有相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性高、在體內(nèi)半衰期長(zhǎng)及脂溶性好的優(yōu)點(diǎn)(二)、SOD的應(yīng)用1、應(yīng)用研究—SOD與順鉑的腎毒性Cis-[Pt(NH3)2C12]十H2O→Cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]2+十2C1-氧化應(yīng)激在順鉑所致腎毒性中的作用

(二)、SOD的應(yīng)用

1、SOD在臨床上的應(yīng)用當(dāng)機(jī)體超氧陰離子自由基產(chǎn)生過(guò)多或SOD濃度偏低時(shí)，過(guò)量的超氧陰離子就會(huì)引起疾病，補(bǔ)充外源性SOD可有效地予以防治。作為第一個(gè)以超氧陰離子自由基為其作用底物的酶被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已充分證明了其在防治與超氧自由基有關(guān)的疾病的作用是有效的。由于SOD是生物體內(nèi)存在的酶，安全無(wú)副反應(yīng)，也很少出現(xiàn)過(guò)敏癥狀。歐美國(guó)家已于1988年批準(zhǔn)它作為一種臨床治療藥物。已在化妝品、牙膏和功能性食品中得到廣泛應(yīng)用。臨床應(yīng)用范圍：A.延緩衰老，清除自由基，阻止自由基連鎖反應(yīng)。B.治療炎癥疾病。C.治療腫瘤和癌癥。1995年報(bào)道，美國(guó)生產(chǎn)的牛血SOD凍干注射劑（商品名奧固肽，Orgotein)已被美國(guó)FDA指定為治療與SOD突變有關(guān)的家族性肌萎縮性側(cè)索硬化的藥物，臨床有效，無(wú)副作用。目前，該藥物已由美國(guó)進(jìn)口我國(guó)，4mg/支，臨床主要用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，放射性膀胱炎，也用于骨關(guān)節(jié)炎。在臺(tái)灣有人將0.1%的SOD凝膠局部應(yīng)用于二至三度燒傷，每日使用兩次，連續(xù)7天。結(jié)果顯示能非常顯著地加速創(chuàng)傷表皮的再生和創(chuàng)傷的愈合。2、SOD在食品工業(yè)上應(yīng)用作為抗衰老功能食品的添加劑，如制成強(qiáng)化SOD的牛奶、飲料、口香糖等系列產(chǎn)品。在食品保健業(yè)中，目前已滲入超氧化物歧化酶的有蛋黃漿、中老年奶粉、可溶性咖啡、啤酒、SOD口服液等。作為抗氧化劑，抑制過(guò)氧化酶的作用，如用于果蔬采后保鮮。3、SOD在化妝品上的應(yīng)用明顯的防曬效果，可有效防止皮膚受電離損傷；有效防止皮膚衰老，祛斑，抗皺，起抗氧化酶的作用。長(zhǎng)期使用可使皮膚富有彈性和光澤，青春常駐添加SOD化妝品種類有：化妝水、露、霜、洗面乳、沐浴液、護(hù)發(fā)素等系列化妝品。4、SOD在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用動(dòng)物上：應(yīng)用SOD有報(bào)道，北京農(nóng)業(yè)大學(xué)用SOD制劑喂養(yǎng)艾維因雞苗，檢測(cè)結(jié)果雞血液中SOD酶活提高21.6％，增重5％，LgG（抗體）水平、球蛋白水平均高于對(duì)照，屠宰率和雞肉質(zhì)量均有明顯提高。其他在肉牛、草魚(yú)、對(duì)蝦的養(yǎng)殖上均獲得類似的結(jié)果。植物上：研究SOD與植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物抗逆性、抗病性及抗衰老等方面研究的較多。最早是中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)梅汝鴻等人在研究增產(chǎn)菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)增產(chǎn)菌中某些菌株（內(nèi)生共生芽孢桿菌）進(jìn)入油菜、水稻、棉花、甘薯等等作物體內(nèi)，植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯增加，在電泳譜帶上表現(xiàn)出凡用增產(chǎn)菌者，酶譜譜帶新增1－2個(gè)帶，同時(shí)譜帶明顯加寬。增產(chǎn)菌劑量加大，SOD酶活量也增加。

1986年開(kāi)始，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)將益微（增產(chǎn)菌）中超氧化物歧化酶（SOD）純化提取出來(lái)，形成制劑、制品、粗酶、精酶、結(jié)晶等五個(gè)層次益微SOD產(chǎn)品。產(chǎn)品方向：

1、酶結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及基因研究，構(gòu)建高產(chǎn)SOD工程菌。2、醫(yī)用治療劑、防衰老保健劑。3、食品添加劑；4、保健化妝品；5、畜禽治療劑。6、飼料添加劑；7、高酶菌；8、菌酶合劑。9、綠色食品；10、促生劑、抗性誘導(dǎo)劑。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)梅汝鴻等人首先將益微SOD用于開(kāi)發(fā)“天然綠色保健功能食品”，現(xiàn)稱“天然功能食品”。已經(jīng)開(kāi)發(fā)的有SOD草莓、SOD蘋果、SOD獼猴桃、SOD獼猴桃果汁、SOD甜瓜、SOD西紅柿、SOD龍眼等。某些產(chǎn)品為國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)，注冊(cè)了商標(biāo)，如“嶺南SOD龍眼”，申請(qǐng)了國(guó)家專利[專利申請(qǐng)?zhí)枺?9310754·0]。

我國(guó)已開(kāi)發(fā)SOD產(chǎn)品主要單位及來(lái)源

SOD來(lái)源SOD金屬離子

單

位牛血Cu、Zn軍事