高效液相色譜法 (續(xù)2) 4

11高效液相色譜法

(續(xù)2)

例如鄰位、間位和對位羥基苯甲酸的Ka1（25℃）分別為1.05×10-3(o-HBA)、8.3×10-5(m-HBA)和2.6×10-5(p-HBA)。它們在水中部分離解，溶液呈弱酸性:

-BondapakC18(4mm×300mm,10m)Ⅰ35%CH3OH+65%H2OⅡ35%CH3OH+0.03%CF3CO2H(pH2.5)

鄰位、間位和對位羥基苯甲酸色譜分析問題：1）硅膠柱能否分離？

2）ODS怎樣分離？四、離子抑制技術(shù)

RCOOHRCOO－＋H＋

如果R基團具有一定的疏水性，當(dāng)降低流動相的酸度,離解增大,造成保留降低；增大流動相酸度,抑制RCOOH離解,保留時間增大。離子抑制色譜正是調(diào)節(jié)流動相合適的pH值,使弱酸或弱堿的有機物得到滿意的分離。

通常，分離弱酸：pH≤pKa–2;而分離弱堿：pH≥pK+2。但實際上,硅基柱離子抑制色譜通常只用于pKa

≥3的弱酸的分離（為什么？），弱堿的分離只能采用聚合物柱。

未保留溶劑峰

o-m-p-酸抑制：o-m-p-五、離子對色譜

RSO3－＋A＋

RSO3A(RSO3A)SP

tR=to(1＋1/×KIP[Cm-]（1）離子對試劑陽離子樣品-己基磺酸鈉；陰離子樣品-四丁基胺鹽。（2）流動相優(yōu)化流動相系統(tǒng)最好是CH3OH/H2O，緩沖液一般是磷酸鹽（pH1.8~3.5和5.8~8.0）和醋酸鹽（pH3.7~5.6）。最好保持柱溫穩(wěn)定。用于分離酸的色譜柱最好與分離堿的色譜柱分開。實驗后要及時清洗：先6-7倍柱體積水（為什么？），再用5%CH3OH/H2O洗至中性。圖IP-HPLC中溶劑優(yōu)化設(shè)計A(CH3OH)B(pH=2.5)C(pH=7.5)D(己烷磺酸鹽)陽離子樣品分析4．應(yīng)用舉例（1）酸和堿混合物的分離（2）金屬螯合物的分離蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基團分布示意圖CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3外部親水內(nèi)疏水核蛋白質(zhì)分子具有四級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜體系，外部有一親水層，內(nèi)部有疏水核。蛋白質(zhì)表面親水性很強，但也存在一些非極性的疏水基團（苯環(huán)等）或疏水區(qū)域。生物大分子色譜鹽析的原因：鹽離子與蛋白質(zhì)表面具有相反電性的基團形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電中性，使蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用減弱而聚集起來；由于中性鹽的親水力比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。

生物樣品中蛋白質(zhì)的除去可采用硫酸銨沉淀法。

蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出（鹽析）。CO2-NH4+NH3+NH3+NH3+SO42+NH4+SO42+蛋白質(zhì)鹽析機理示意圖

六、疏水作用色譜

疏水相互作用色譜法（HIC）指采用適度疏水性的固定相,以含鹽的水溶液作為流動相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）鍵合相色譜方法。

其特點是：采用中性或接近中性的鹽水溶液洗脫,樣品的生物活性高,成本低等。疏水色譜中無機鹽的作用與鹽析沉淀蛋白質(zhì)的作用十分相似。

在HIC中,通常使用大孔徑(~100nm)聚合物凝膠上鍵合一層低密度苯基官能團的有機物為柱填料(如5PW-HIC)的色譜柱,而使用的洗脫劑一般是中性鹽緩沖液,

洗脫方式采用降低鹽濃度的梯度方式。

HIC分離原理:是基于欲分離的物質(zhì)表面憎水性殘基與固定相表面苯基之間的相互作用。在高離子強度的緩沖液中,這些含大量憎水殘基的生物物質(zhì)很容易與固定相表面的苯基產(chǎn)生非極性相互作用。通過梯度洗脫技術(shù)降低洗脫劑的離子強度可減弱這些物質(zhì)與固定相之間的相互作用,將組分一一分離。圖蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的分離比較1細胞色素C2肌紅蛋白3溶菌酶TSK5PW硫酸銨從1.7減少到0.1mol/LRP-304乙腈從0增加到100%疏水作用色譜與反相色譜的比較★（固定相的差別）HIC填料表面疏水性沒有RPC強：疏水基團一般是低密度的苯基、戊基、丁基、丙基等★（流動相的差別）

HIC一般采用pH6-8的鹽水溶液[如(NH4)2SO4]，作降濃度洗脫。在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來★（應(yīng)用特點）HIC分離條件有利于蛋白質(zhì)保持活性，回收率高離子性化合物如何分離？●光度檢測的可行性

鹵素、無機酸根和一些弱的有機酸根離子，在可見或紫外區(qū)域沒有光吸收或吸收很弱。所以用一般的紫外、可見及示差折光檢測器進行檢測時，很難獲得滿意的結(jié)果。●抑制或離子對色譜●離子交換色譜(IEC)離子化合物如何檢測？●電導(dǎo)檢測的可行性：

電導(dǎo)是離子的通用性質(zhì)，但洗脫液的電導(dǎo)如何消除？通常離子交換色譜采用較高濃度的酸/堿/鹽為淋洗液，淋洗液本身具有較高的電導(dǎo)（淋洗液的電導(dǎo)，通常稱為“本底電導(dǎo)”或“基體電導(dǎo)”）。待測離子的電導(dǎo)變化往往會被淋洗液的本底電導(dǎo)所掩蓋（為什么？），難以采用電導(dǎo)檢測器進行檢測。11.7離子色譜(IonChromatography)

離子交換色譜（IEC）是最先得到應(yīng)用的液相色譜分析方法。目前，離子交換色譜不如其它HPLC模式應(yīng)用廣泛，許多離子混合物分析應(yīng)用被離子對色譜和離子色譜所代替。

氨基酸的分離：采用強酸型陽離子交換樹脂，不同的酸度和離子強度分段洗脫。①氨基酸分析儀②柱后衍生檢測（如茚三酮）●糖類的分離：糖化合物與硼酸生成絡(luò)陰離子,用陰離子交換樹脂進行分離。

離子色譜的由來：早期的IEC，缺少相匹配的檢測器，難于發(fā)揮更大的作用。如無機離子與大多數(shù)有機離子不同，只有在遠紫外區(qū)才有吸收，光度檢測器不適合于檢測無機離子；但在IEC中,通常采用強電解質(zhì)作洗脫液,流動相的本底電導(dǎo)淹沒了樣品離子的電導(dǎo),使得人們無法采用通用的電導(dǎo)檢測器進行檢測。

離子色譜是一種分析離子化合物的液相色譜,它是在離子交換色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1975年Small發(fā)明了采用電導(dǎo)檢測器檢測離子交換色譜流出液的方法。為有別于以往的離子交換色譜法，他把這一方法稱為“離子色譜”。為什么需要抑制背景電導(dǎo)？X-/NaHCO3-Na2CO3

500t/minFCl5001放大檢測信號，背景信號同時增大，并不能改善檢測限分離柱抑制柱一、離子色譜法的基本原理淋洗液槽泵進樣閥分離柱電導(dǎo)檢測抑制柱記錄儀輸送分離檢測數(shù)據(jù)處理圖離子色譜儀流程圖圖淋洗液抑制反應(yīng)對離子檢測的影響離子交換柱●分離過程：當(dāng)淋洗液將樣品離子X-帶到陰離子交換分離柱時，由于各種離子對離子交換樹脂的親合力不同，樣品在分離柱上分離成不連續(xù)的譜帶，并依次被淋洗液洗脫下來并與淋洗液一起流出分離柱。交換：R+-OH-+Na+X-→R+-X-+Na+OH-洗脫：R+-X-+Na+OH-→R+-OH-+Na+X-

離子色譜基本原理高效離子交換色譜分離電導(dǎo)抑制器（最常見檢測方式）1）分析柱的選擇？2）出峰順序？如鹵素陰離子？3）如何獲得高柱效？思考題：●抑制過程：當(dāng)分離后的樣品離子與淋洗液一起進入抑制柱時，由于抑制柱中填充有陽離子交換樹脂，淋洗液與分析樣品就發(fā)生了如下的反應(yīng)：

Na+OH-+R--H+→R--Na++H2ONa+X-+R--H+→R--Na++H+X-

由此可見淋洗液中Na+置換出H+，把OH-中和成水，消除了原來淋洗液的高電導(dǎo)，有利于電導(dǎo)檢測器進行檢測；同時待測離子與氫離子形成強酸離子對，在陽離子中由于氫離子的極限摩爾電導(dǎo)最大，這樣就有利于陰離子的分析。注意：電導(dǎo)檢測器是一種通用性檢測器，它檢測的溶液中陰離子和陽離子的電導(dǎo)總和。思考題：1）抑制柱的選擇？2）如何獲得大容量抑制柱？3）試分析NaHCO3-Na2CO3洗脫液的抑制過程。

離子色譜→電導(dǎo)檢測→抑制原理離子色譜法解決了陰離子型化合物長期以來缺乏快速靈敏分析方法問題。目前它是陰離子分離分析的首選方法（無機陰離子分析的“ICP”方法）。從無機和有機陰離子到金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、氨基酸等均可用離子色譜法進行分析。環(huán)境分析水質(zhì)分析

AB圖用填充樹脂抑制柱時電導(dǎo)檢測器檢測的變化

1.F-

，2.Cl-

，3.NO2-

，4.H2PO32-

，5.Br-

，6.NO3-

，7.SO42-用新再生的填充樹脂抑制柱時獲得的色譜圖用耗用了一半的填充樹脂抑制柱時獲得的色譜圖(A)(B)二、離子色譜抑制器化學(xué)抑制

抑制器是離子色譜儀電導(dǎo)檢測的一個核心部件，抑制能力和使用的方便性是其主要性能指標(biāo)?！駱渲畛涫揭种浦窭w維管抑制柱●平板微膜抑制柱●電化學(xué)抑制器（重點）

抑制容量：單位時間內(nèi)抑制柱可抑制的淋洗離子的摩爾數(shù)。1）樹脂填充式抑制柱陰離子分析：分離柱采用低容量強堿型陰離子交換柱,常用NaHCO3和Na2CO3混合液作流動相；串聯(lián)在分析柱后面的抑制柱則采用高容量的強酸型陽離子交換柱。

樹脂填充式抑制柱缺點：

A.抑制柱需定期再生。（如何再生？）

B.弱酸陰離子和弱堿陽離子在抑制柱中的行為復(fù)雜。陽離子分析：分離柱為低交換容量強酸型陽離子交換樹脂,而抑制柱是交換容量大的強堿型陰離子交換樹脂,洗脫液中高電導(dǎo)的H＋被抑制柱反應(yīng)生成低電導(dǎo)的水,最后檢測的是流出液中的M＋和OH－的電導(dǎo)。

2）纖維管抑制柱

采用磺化的聚乙烯陽離子交換空心纖維管為抑制柱。在纖維管外表面通過與淋洗液（NaHCO3）逆向而行的再生液（H2SO4）。當(dāng)淋洗液（NaHCO3）通過纖維管時，陽離子Na+被庫侖力吸引到管壁的離子—SO3-基上，同時再生液（H2SO4）中的質(zhì)子也被吸引，并通過下述反應(yīng)不斷消耗H+，使H+透過膜的擴散不斷進行以下反應(yīng)：CO32-+H+→H2CO3優(yōu)點：實現(xiàn)抑制柱的在線再生，克服了填充式定期再生的問題。缺點：離子交換速度慢；纖維管的加工工藝復(fù)雜，管內(nèi)有時會產(chǎn)生氣泡，干擾測量，還需推動再生液的裝置；受淋洗液強度限制，不能進行梯度洗脫。

圖纖維管抑制柱CO32-+H+→H2CO3H2SO4NaHCO3+X-H+Na+陽離子交換膜3）平板微膜抑制柱85年,Dionex公司★在流出液通道填充細目交換劑，提高了離子交換速度，從而提高了抑制柱的交換容量★抑制柱的死體積小檢測器分離柱4）電化學(xué)抑制器85年，田昭武、胡榮宗等研制成功XYZ-1型電化學(xué)抑制柱。92年，Dionex公司推出SRS系列電化學(xué)抑制柱。海水淡化----電滲析原理+-鹽水淡水極水1離子在電場下的定向遷移2膜的選擇性透過3分離對象/產(chǎn)品的去向關(guān)注電化學(xué)抑制器的工作原理圖電化學(xué)膜抑制器的抑制原理(陰離子分析)對比電滲析●膜類型及位置●離子的遷移●作用及目的思考題：試設(shè)計用于陽離子分析的電化學(xué)抑制器。電化學(xué)抑制器陽極室的H+穿過陽離子膜進入中間的抑制室：

HCO3-+H+→H2CO3流出液中Na+的穿過陽離子膜進入陰極室流出液中的樣品離子Cl-的電遷移受到陽離子膜的阻斷Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3+-H+

Na+

Cl-

H2SO4

+-鹽水淡水+-Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3抑制器與電滲析對比原理相同目的不同陽極室膜的種類不同電化學(xué)抑制的特點●與化學(xué)抑制柱不同，電化學(xué)抑制器是以電場力作為離子遷移的動力，提高了抑制速度，從而提高了抑制柱的抑制容量和縮短了抑制時的平衡時間?！袷闺妼?dǎo)檢測的梯度淋洗成為了可能。圖電再生固相抑制柱(ERIS)的抑制和再生示意圖圖離子逆流原理近幾年來，Alltech

公司提出了一種電再生固相抑制柱(ERIS)以實現(xiàn)再生液的自再生和抑制柱的連續(xù)工作；Small提出了“離子逆流”原理，在一根抑制柱上實現(xiàn)了將淋洗液的產(chǎn)生、陰離子的分離和淋洗液的抑制都集中在一根抑制柱中自動完成。（結(jié)合查考文獻自學(xué)?。┤?、非抑制離子色譜“單柱法”

單柱離子色譜法的基本原理是以低容量的離子交換色譜柱分離，采用低電導(dǎo)低濃度的洗脫液，由于降低了洗出液本底電導(dǎo)水平，這樣可采用電導(dǎo)檢測器檢測樣品離子的電導(dǎo)。單柱法通常可在普通色譜儀上進行。陰離子分析可用低濃度（1×10-4-1×10-5mol/L）的苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽作為洗脫劑；陽離子分析則采用1-2mol/L的HNO3或乙二胺鹽作為洗脫劑。

在使用上，雙柱法具有較高的靈敏度，但死體積較大；而單柱法死體積較小，比雙柱法使用更低濃度的洗脫劑以及更低交換容量的填料，但由于其柱容量小，因此，進樣量受到一定的限制。

單柱法的檢測：電導(dǎo)法和間接光度法

間接光度法是一種離子對探針檢測無紫外響應(yīng)物質(zhì)的技術(shù)。在離子色譜中，如果流動相含有吸收紫外光性能的洗脫離子，那么可以采用紫外檢測器間接檢測無紫外吸收的樣品離子。四、間接光度色譜法

(Indirectphotometricchromatography)方法原理：在陰離子分離中，假設(shè)以具有吸收紫外光性能的洗脫掖Na+E-溶液來洗脫無吸收的樣品液Na+S-

，可以通過檢測E-的變化來間接測定S-。因為基于交換平衡原理和電中性原理，在流出液中，當(dāng)S-離子出現(xiàn)時，洗脫劑中的E-離子必然有一協(xié)調(diào)的、等當(dāng)量的改變（Na+的濃度確定，S-增大，E-則減少），這樣連續(xù)監(jiān)測洗脫離子E-的濃度變化，從而反應(yīng)出S-離子在柱中被分離的情況。間接光度法出現(xiàn)負峰色譜圖，可將信號轉(zhuǎn)化為“正峰”處理?？梢娫陂g接光度色譜法中，洗脫劑的吸收光離子具有雙重作用：

l

從色譜分離柱中選擇性地洗脫樣品離子

l

在流出液中充當(dāng)樣品離子的探針

此外，對于無吸收的樣品離子間接光度法的色譜峰面積只與樣品離子的濃度有關(guān)，而與樣品的種類無關(guān)，同時靈敏度隨所用洗脫劑的濃度的降低而增大。

除了傳統(tǒng)的以抑制柱為特點的離子交換色譜（HPIC）外，離子色譜技術(shù)還出現(xiàn)了以Donnan排斥、空間排阻和吸附過程為分離機理的離子排斥色譜（HPIEC）和以吸附為分離機理的離子對色譜（MPIC）。五、離子排斥色譜

(IonExclusionChromatography，IEC)

高容量陽離子交換樹脂使樣品陰離子由于受到Donnan排斥很快流出色譜柱,而低電離度弱酸分子能進入到樹脂內(nèi)部，且通過溶質(zhì)與樹脂功能團之間的極性相互作用和溶質(zhì)與樹脂基體間的非極性相互作用為固定相保留。因此，在離子排斥色譜中溶質(zhì)的保留作用取決于：

l

溶質(zhì)受阻程度的不同

l

溶質(zhì)與樹脂功能團間極性相互作用的差別

l

溶質(zhì)與樹脂功能團間非極性相互作用的差別

離子排斥色譜主要用于有機酸無機弱酸和醇類的分離。如用離子排斥色譜柱,稀鹽酸為流動相,可分析30余種常見的水可溶性有機酸,其中包括用氣相色譜難于分析的羥基有機酸。

強酸中弱有機酸的測定，用陰離子交換分離是非常困難的。例如2.5g/L硫酸中1.0mg/L脂肪酸等弱酸（為什么？）。

但用IEC，硫酸根不被保留，不干擾弱酸（檸檬酸、羥基丁二酸、乙醇酸、乙酸、丁二酸）的定量。11.8體積排阻色譜

(SizeExclusionChromatography,SEC)

體積排阻色譜,也稱為凝膠色譜,包括:?凝膠過濾色譜(GFC):,以水為流動相?凝膠滲透色譜(GPC):以有機溶劑為流動相。

在許多色譜模式探索中,人們往往從溶質(zhì)——固定相——流動相之間的相互作用力來討論色譜分離問題。流動相溶劑的選擇非常重要。

對于排阻色譜，這一思路是否可行？排阻色譜分離機理:(注意與其它液相色譜的不同點）一般液相色譜是根據(jù)樣品組分在固定相和流動相之間的平衡分配系數(shù)不同，造成不同的移動速度而達到分離。而排阻色譜是根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效體積、流體力學(xué)體積)的差別進行分離的。它主要應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測定,在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。1．排阻色譜分離過程

排阻色譜的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)(交聯(lián)聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅膠等)為填料的柱中進行的,填料的孔徑在制備時已嚴格加以控制。.溶質(zhì)在填料中的滲透體積不同樣品分子通過多孔填料的排阻機理示意圖

如果某樣品分子太大不能進入填料的孔中,就會被填料所排阻。這些大的樣品分子直接流過柱子,并首先在色譜圖上出現(xiàn)。一些小到幾乎可滲透到整個填料顆粒的樣品分子具有最大保留值,通過柱子最慢,并最后在色譜圖上出現(xiàn)。而中等體積的樣品分子靠近孔壁的可能較小,平均來說,這些分子在孔中停留的時間較短,它們通過柱子的速度取決于它們的相對大小。色譜柱體積：

Vc=VM+VS+V式中V為填料體積，VS為填料微孔隙總體積,VM為柱空隙體積（顆粒間隙體積）。組分的洗脫體積：

Ve=VM＋KdVS

式中Kd為排阻色譜的分配系數(shù),它表示組分分子可以擴散進入的內(nèi)孔體積(即對某種尺寸的溶質(zhì)分子來說可以滲透進去的那部分孔體積)與內(nèi)孔總體積之比。

排阻色譜中樣品分子的大小是指它在流動相中的有效體積,即它在流動相中的轉(zhuǎn)動半徑,這與分子的幾何形態(tài)(球形、棒形或無規(guī)則卷曲形)和溶劑化作用有關(guān)。?Kd=0,Ve=VM

樣品分子被完全排阻；?Kd=1,Ve=VM＋VS

樣品分子完全滲透（自由擴散）；?0<Kd<1,VM<Ve<VM＋VS

樣品分子選擇性滲透,樣品組分按它們的分子大小被分離。出峰順序為從大到小,均在溶劑峰之前流出柱子。思考：1）排阻色譜的出峰順序？

2）洗脫溶劑對分離是否有影響？

在排阻色譜中，選擇性僅與分子大小的差異有關(guān)。要改進分離度只能靠凝膠的孔徑大小和孔徑分布的最佳化來實現(xiàn)。由懸浮聚合產(chǎn)生的均勻球型微粒能提供高的柱效率。與其它色譜的最大的區(qū)別為洗脫出的組分峰寬相等。排阻色譜(SEC)—色譜柱校正曲線Eluent:THF（2）分離模型（自學(xué)）：所謂的分離機理就是根據(jù)一定的物理模型,用分子參數(shù)和柱結(jié)構(gòu)參數(shù)來計算Ve和K。目前有三種分離理論：①平衡理論：認定分子擴散進入填料顆粒的孔中并再出來所需的時間遠小于溶質(zhì)區(qū)段在此停留的時間,溶質(zhì)分子出入孔達到了平衡。在其它形式的液相色譜中，溶質(zhì)在流動相和固定相之間進行分配。不管是吸附或分配都涉及到兩相之間的移動，伴隨著分子間和實際存在的熱焓變化，而熵在這種色譜分離過程中的變化十分小，常常忽略不計。由于ΔH一般為負值，因此K值大于1，即溶劑峰先于溶質(zhì)峰流出。在體積排阻色譜中主要是熵的變化，ΔH≈0，所以

排阻色譜運行時，溶質(zhì)在填料微孔中的流動有一定的限制，因此，溶質(zhì)的滲透伴隨著熵的降低。由于溶質(zhì)峰是先于溶劑峰洗脫，Kd值自然小于1，而且是一個不受溫度影響的參數(shù)。ΔS對一切溶質(zhì)均為負值，同時在分離過程中可以控制。②限制擴散理論：認為分離是由不同尺寸的聚合物分子在往孔中擴散時其擴散速度的不同決定的。③流動分離理論：速度的流型分布決定分離。（3）聚合物在體積排