2023年基因工程和細胞工程整理后的知識點

專題1

基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,通過體外DNA重組和轉基因技術,賦予生物以新的遺傳特性，發(fā)明出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品?；蚬こ淌窃贒NA分子水平上進行設計和施工的,又叫做DＮA重組技術。操作水平:分子原理：基因重組(一)基因工程的基本工具1.“分子手術刀”——限制性核酸內切酶（限制酶)(1）來源:重要是從原核生物中分離純化出來的。（2)功能：可以辨認雙鏈DＮA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。（3)結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式:黏性末端和平末端。2.“分子縫合針”——DNA連接酶(１)兩種DNA連接酶(E·coliDＮA連接酶和T４-DNA連接酶)的比較:①相同點:都縫合磷酸二酯鍵。②區(qū)別:E·cｏｌiDＮA連接酶來源于Ｔ4噬菌體,只能將雙鏈DＮA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T４DＮＡ連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。（2)與DNA聚合酶作用的異同:?????????????DＮA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵。３.“分子運送車”——載體（1)載體具有的條件：①能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存。②具有一至多個限制酶切點，供外源DNＡ片段插入。③具有標記基因，供重組DＮA的鑒定和選擇。（２)最常用的載體是??質粒,它是一種裸露的、結構簡樸的、獨立于細菌染色體之外,并具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀DＮA分子。(3）其它載體：噬菌體的衍生物、動植物病毒（二)基因工程的基本操作程序一基因的結構:基因是有遺傳效應的DNA片段(注:ＲNA病毒為RNA),分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū):能轉錄出mＲＮA,原核生物中也就是能編碼蛋白質的區(qū)段非編碼區(qū):不能轉錄出ｍRＮA,也不能編碼蛋白質的區(qū)段（１)原核細胞基因的結構非編碼區(qū)中存在調控遺傳信息表達的核苷酸序列：①編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點,即啟動子,可控制RNA聚合酶的結合。ＲNＡ聚合酶是一種蛋白質，能辨認并結合調控序列中的結合位點,能催化DＮA轉錄為RNA②編碼區(qū)下游有終止子,可控制RＮA聚合酶的停止、脫落。(2)真核細胞基因的結構第一步:目的基因的獲取1．目的基因是指：編碼蛋白質的結構基因。2．原核基因采用直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法_和化學合成法_。3．ＰＣR技術擴增目的基因（１）原理：DNA雙鏈復制（2)過程：第一步:加熱至90~9５℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃,引物結合到互補DNA鏈;第三步:加熱至7０～75℃,熱穩(wěn)定DＮA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。(3）前提：一段已知目的基因的核苷酸序列,根據這一序列合成引物。(4)條件：a．.四種脫氧核苷酸b．DＮA的兩條鏈為模板ｃ.熱穩(wěn)定DNＡ聚合酶（Ｔaq酶）d．一對引物(一小段單鏈DNA或RNA，一般20~30個堿基，能與DNＡ母鏈的一段堿基序列互補配對）

ｅ.溫度控制和緩沖液4.從基因文庫中獲取目的基因：基本概念的理解：①將具有某種生物不同基因的許多DＮA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別具有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。②將某種生物體內的DNA所有提取出來，選用適當的限制酶，將DNＡ切成一定范圍大小的DＮA片段,然后將這些片段分別與載體連接起來，導入受體菌的群體中儲存,每個受體菌都具有了一段不同的DＮA片段。這個群體包含了這種生物的所有基因。這種基因文庫叫基因組文庫。③有些基因文庫比較小,只包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫，如ｃＤNA文庫（用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DＮA（也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中,這個受體菌群體叫做這種生物cDNA文庫。）如何提?。焊鶕康幕蛴嘘P信息，例如,根據基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色體的位置，基因的轉錄產物mRNA以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。5.人工合成：①反轉錄法:以目的基因轉錄成的信使RNA為模板,反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需的基因。

目的基因轉錄成的mRＮA單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因)②根據已知的氨基酸序列合成DNA法:蛋白質中氨基酸的序列mＲNA中的堿基序列ＤNA堿基序列目的基因目的基因第二步：基因表達載體的構建１．目的:使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳至下一代,使目的基因可以表達和發(fā)揮作用。2．組成:目的基因+啟動子＋終止子＋標記基因（1)啟動子:是一段有特殊結構的DＮA片段，位于基因的首端，是ＲＮA聚合酶辨認和結合的部位,能驅動基因轉錄出mRNA,最終獲得所需的蛋白質。（2)終止子：也是一段有特殊結構的DNＡ片段,位于基因的尾端。（3)標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否具有目的基因，從而將具有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。第三步：將目的基因導入受體細胞_1.轉化的概念:是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。2.常用的轉化方法：將目的基因導入植物細胞:采用最多的方法是農桿菌轉化法，另一方面尚有基因槍法和花粉管通道法等。將目的基因導入動物細胞:最常用的方法是顯微注射技術。此方法的受體細胞多是受精卵。將目的基因導入微生物細胞:原核生物作為受體細胞的因素是繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少,最常用的原核細胞是大腸桿菌,其轉化方法是：先用Ca2+解決細胞，使其成為感受態(tài)細胞,再將重組表達載體DＮA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸?。腘A分子,完畢轉化過程。３．第四步:目的基因的檢測和表達1．一方面要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用ＤNA分子雜交技術。2.另一方面還要檢測目的基因是否轉錄出了ｍRＮA,方法是采用用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。３.最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原－抗體雜交。4.有時還需進行個體生物學水平的鑒定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。(三)基因工程的應用1.植物基因工程:抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物,運用轉基因改良植物的品質。2．動物基因工程:3.基因治療:把正常的外源基因導入病人體內,使該基因表達產物發(fā)揮作用。（四)蛋白質工程的概念蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎,通過基因修飾或基因合成,對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質,以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質）轉錄翻譯專題2細胞工程(一)植物細胞工程:細胞或細胞器水平的操作1.理論基礎（原理）:細胞全能性全能性表達的難易限度:受精卵>生殖細胞>干細胞＞體細胞；植物細胞>動物細胞２.植物組織培養(yǎng)技術（1)過程:離體的植物器官、組織或細胞（外植體）―→愈傷組織―→試管苗―→植物體（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細胞產物的工廠化生產。A植物繁殖微型繁殖:可以高效快速地實現種苗的大量繁殖作物脫毒:采用莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒(由于植物分生區(qū)附近的病毒很少或沒有）人工種子:以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料,經人工薄膜包裝得到的種子。優(yōu)點:完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性,不受季節(jié)的限制；方便儲藏和運送B作物新品種哺育單倍體育種：ａ過程:植株(AaBb)通過減數分裂得到花粉（ＡＢ、Ａｂ、aB、aｂ四種類型)；對花粉進行花藥離體培養(yǎng)(技術是植物組織培養(yǎng));得到單倍體植株；對其幼苗時期進行秋水仙素解決；得到了正常的純合二倍體植株（AAＢB、AAｂb、aａBＢ、aａbb四種類型)。b優(yōu)點:明顯縮短育種年限C突變體運用：在組織培養(yǎng)中會出現突變體,通過從有用的突變體中選育出新品種(如篩選抗病、抗鹽、含高蛋白的突變體)D細胞產物的生產:通過可以產生對人們有利的產物的細胞進行組織培養(yǎng),從而讓它們可以產生大量的細胞產物。(3）地位：是哺育轉基因植物、植物體細胞雜交哺育植物新品種的最后一道工序。3．植物體細胞雜交技術(1)過程:注意：核融合標志原生質融合結束再生壁形成標志著雜種細胞形成雜種植株形成標志著植物體細胞雜交技術結束目的：為了獲得雜種植株原理：膜的流動性和細胞全能性(2)誘導融合的方法:物理法涉及離心、振動、電刺激等?；瘜W法一般是用聚乙二醇（PEG)作為誘導劑。(3）意義：克服了遠緣雜交不親和的障礙。(二)動物細胞工程１.動物細胞培養(yǎng)（1）概念:動物細胞培養(yǎng):動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和繁殖。原代培養(yǎng)定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)定義:當原代培養(yǎng)的細胞處在接觸克制后,用胰蛋白酶解決,使細胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內轉接到新的培養(yǎng)瓶內,這個過程稱傳代培養(yǎng)．(分瓶培養(yǎng)的過程）細胞株:傳代細胞一般能傳到40-５0代,遺傳物質一般不會發(fā)生改變，叫細胞株細胞系:傳代50代以后又出現細胞生長停滯狀態(tài),部分細胞遺傳物質發(fā)生了改變,能連續(xù)傳代,獲得不死性,叫細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點,失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。(２）動物細胞培養(yǎng)的流程：取動物組織塊(動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶解決分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶解決分散成單個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。(3)細胞貼壁和接觸克制：懸液中分散的細胞不久就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞數目不斷增多，當貼壁細胞分裂生長到表面互相克制時,細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸克制。（４）原理:細胞增殖（5)動物細胞培養(yǎng)需要滿足以下條件①無菌、無毒的環(huán)境:培養(yǎng)液應進行無菌解決。通常還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素,以防培養(yǎng)過程中的污染。此外，應定期更換培養(yǎng)液，防止代謝產物積累對細胞自身導致危害。②營養(yǎng)：合成培養(yǎng)基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。③溫度:適宜溫度:哺乳動物多是36.5℃+0.5℃;pH：④氣體環(huán)境:(5）動物細胞培養(yǎng)技術的應用:制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質、培養(yǎng)醫(yī)學研究的各種細胞。2.動物體細胞核移植技術和克隆動物（1)哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易)和體細胞核移植（比較難)。(2）選用去核卵(母)細胞的因素：卵（母)細胞比較大,容易操作；卵(母)細胞細胞質多，營養(yǎng)豐富。卵母細胞培養(yǎng)到減數第二次分裂中期(3）體細胞核移植的大體過程是：(右圖)核移植胚胎移植（4)體細胞核移植技術的應用:①加速家畜遺傳改良進程,促進良畜群繁育；②保護瀕危物種,增大存活數量;③生產珍貴的醫(yī)用蛋白;④作為異種移植的供體；⑤用于組織器官的移植等。(5)體細胞核移植技術存在的問題：克隆動物存在著健康問題、表現出遺傳和生理缺陷等。3.動物細胞融合（1)動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有本來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。(2）動物細胞融合與植物原生質體融合的原理基本相同,誘導動物細胞融合的方法與植物原生質體融合的方法類似，常用的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。(3)動物細胞融合的意義:克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種哺育的重要手段。（４）原理：膜的流動性（5）為了獲得雜交細胞(6）動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較:比較項目細胞融合的原理細胞融合的方法誘導手段用法植物體細胞雜交細胞膜的流動性去除細胞壁后誘導原生質體融合離心、電刺激、振動，聚乙二醇等試劑誘導克服了遠緣雜交的不親和性，獲得雜種植株動物細胞融合細胞膜的流動性使細胞分散后誘導細胞融合除應用植物細胞雜交手段外，再加滅活的病毒誘導制備單克隆抗體的技術之一4．單克隆抗體（1)抗體：一個Ｂ淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產量低、純度低、特異性差。(2)單克隆抗體的制備過程:注入小鼠注入小鼠細胞融合分離抗原注入小鼠體內B淋巴細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基體內培養(yǎng)體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體(3)雜交瘤細胞的特點:既能大量繁殖,又能產生專一的抗體。(4）單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強,靈敏度高，并能大量制備。(５）單克隆抗體的作用:①作為診斷試劑:準確辨認各種抗原物質的細微差異,并跟一定抗原發(fā)生特異性結合，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。②用于治療疾病和運載藥物：重要用于治療癌癥治療，可制成“生物導彈”，也有少量用于治療其它疾病。專題三：胚胎工程１、精子的發(fā)生大體可以分為三個階段：精原細胞↓有絲分裂分裂,發(fā)生在睪丸曲細精管。精原細胞（部分精原細胞仍然保持為精原細胞)↓滋長，完畢ＤNA復制和相關蛋白質合成,即進行染色體復制復制。初級精母細胞（開始減數分裂分裂）由中心體發(fā)育_____________↓減I分裂_____________高爾基體次級精母細胞高爾基體↓減Ⅱ分裂頭細胞核精（子）細胞頭細胞核_________↓這是精子形成_________線粒體鞘線粒體的第三個階段：線粒體鞘線粒體精子精細胞精子由細胞質的其他部分發(fā)育２、卵子形成:⑴胚胎在性別分化以后，雌性胎兒卵巢內的卵原細胞，通過有絲分裂,不斷增長數量,并經DNA復制和相關蛋白質合成,即復制，滋長，成為初級卵母細胞細胞,這個細胞被卵泡細胞包圍，成為卵泡。即雌性胎兒在出生時,已經準備好了所有的初級卵母細胞(卵泡)。初級卵母細胞⑵排卵：是指卵子從卵泡中排出，排出時是初級卵母細胞細胞（馬、犬）或者是次級卵母細胞細胞（豬、羊）。初級卵母細胞⑶卵子形成過程中的減數分裂：減數第一次分裂在排卵前后完畢,產生一個次級卵母細胞和第一極體,進入輸卵管，減數第二次分裂在輸卵管過程中完畢,標志是:在的間隙可以觀測到二個極體的時候。卵黃膜透明帶放射冠卵黃膜透明帶放射冠3、受精作用⑴準備階段：①精子準備:精子必需在雌性生殖道中運營一段時間，稱精子獲能。在體外受精操作時要人工進行。②卵子準備：排卵時排出的是初級卵母細胞