2023年基因工程和細(xì)胞工程整理后的知識點(diǎn)

專題1

基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計,通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù),賦予生物以新的遺傳特性，發(fā)明出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃贒NA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的,又叫做DＮA重組技術(shù)。操作水平:分子原理：基因重組(一)基因工程的基本工具1.“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶)(1）來源:重要是從原核生物中分離純化出來的。（2)功能：可以辨認(rèn)雙鏈DＮA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。（3)結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式:黏性末端和平末端。2.“分子縫合針”——DNA連接酶(１)兩種DNA連接酶(E·coliDＮA連接酶和T４-DNA連接酶)的比較:①相同點(diǎn):都縫合磷酸二酯鍵。②區(qū)別:E·cｏｌiDＮA連接酶來源于Ｔ4噬菌體,只能將雙鏈DＮA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T４DＮＡ連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。（2)與DNA聚合酶作用的異同:?????????????DＮA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵。３.“分子運(yùn)送車”——載體（1)載體具有的條件：①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。②具有一至多個限制酶切點(diǎn)，供外源DNＡ片段插入。③具有標(biāo)記基因，供重組DＮA的鑒定和選擇。（２)最常用的載體是??質(zhì)粒,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡樸的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外,并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DＮA分子。(3）其它載體：噬菌體的衍生物、動植物病毒（二)基因工程的基本操作程序一基因的結(jié)構(gòu):基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段(注:ＲNA病毒為RNA),分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū):能轉(zhuǎn)錄出mＲＮA,原核生物中也就是能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段非編碼區(qū):不能轉(zhuǎn)錄出ｍRＮA,也不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段（１)原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)中存在調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列：①編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),即啟動子,可控制RNA聚合酶的結(jié)合。ＲNＡ聚合酶是一種蛋白質(zhì)，能辨認(rèn)并結(jié)合調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn),能催化DＮA轉(zhuǎn)錄為RNA②編碼區(qū)下游有終止子,可控制RＮA聚合酶的停止、脫落。(2)真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)第一步:目的基因的獲取1．目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。2．原核基因采用直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法_和化學(xué)合成法_。3．ＰＣR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（１）原理：DNA雙鏈復(fù)制（2)過程：第一步:加熱至90~9５℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃,引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈;第三步:加熱至7０～75℃,熱穩(wěn)定DＮA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。(3）前提：一段已知目的基因的核苷酸序列,根據(jù)這一序列合成引物。(4)條件：a．.四種脫氧核苷酸b．DＮA的兩條鏈為模板ｃ.熱穩(wěn)定DNＡ聚合酶（Ｔaq酶）d．一對引物(一小段單鏈DNA或RNA，一般20~30個堿基，能與DNＡ母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對）

ｅ.溫度控制和緩沖液4.從基因文庫中獲取目的基因：基本概念的理解：①將具有某種生物不同基因的許多DＮA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別具有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。②將某種生物體內(nèi)的DNA所有提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNＡ切成一定范圍大小的DＮA片段,然后將這些片段分別與載體連接起來，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,每個受體菌都具有了一段不同的DＮA片段。這個群體包含了這種生物的所有基因。這種基因文庫叫基因組文庫。③有些基因文庫比較小,只包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫，如ｃＤNA文庫（用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DＮA（也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中,這個受體菌群體叫做這種生物cDNA文庫。）如何提取：根據(jù)目的基因有關(guān)信息，例如,根據(jù)基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色體的位置，基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。5.人工合成：①反轉(zhuǎn)錄法:以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需的基因。

目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRＮA單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因)②根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法:蛋白質(zhì)中氨基酸的序列mＲNA中的堿基序列ＤNA堿基序列目的基因目的基因第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建１．目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳至下一代,使目的基因可以表達(dá)和發(fā)揮作用。2．組成:目的基因+啟動子＋終止子＋標(biāo)記基因（1)啟動子:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DＮA片段，位于基因的首端，是ＲＮA聚合酶辨認(rèn)和結(jié)合的部位,能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終獲得所需的蛋白質(zhì)。（2)終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNＡ片段,位于基因的尾端。（3)標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否具有目的基因，從而將具有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞_1.轉(zhuǎn)化的概念:是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2.常用的轉(zhuǎn)化方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞:采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，另一方面尚有基因槍法和花粉管通道法等。將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞:最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞:原核生物作為受體細(xì)胞的因素是繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少,最常用的原核細(xì)胞是大腸桿菌,其轉(zhuǎn)化方法是：先用Ca2+解決細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞,再將重組表達(dá)載體DＮA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸?。腘A分子,完畢轉(zhuǎn)化過程。３．第四步:目的基因的檢測和表達(dá)1．一方面要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用ＤNA分子雜交技術(shù)。2.另一方面還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了ｍRＮA,方法是采用用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。３.最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜交。4.有時還需進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。(三)基因工程的應(yīng)用1.植物基因工程:抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物,運(yùn)用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。2．動物基因工程:3.基因治療:把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用。（四)蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ),通過基因修飾或基因合成,對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì),以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)錄翻譯專題2細(xì)胞工程(一)植物細(xì)胞工程:細(xì)胞或細(xì)胞器水平的操作1.理論基礎(chǔ)（原理）:細(xì)胞全能性全能性表達(dá)的難易限度:受精卵>生殖細(xì)胞>干細(xì)胞＞體細(xì)胞；植物細(xì)胞>動物細(xì)胞２.植物組織培養(yǎng)技術(shù)（1)過程:離體的植物器官、組織或細(xì)胞（外植體）―→愈傷組織―→試管苗―→植物體（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。A植物繁殖微型繁殖:可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖作物脫毒:采用莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒(由于植物分生區(qū)附近的病毒很少或沒有）人工種子:以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料,經(jīng)人工薄膜包裝得到的種子。優(yōu)點(diǎn):完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性,不受季節(jié)的限制；方便儲藏和運(yùn)送B作物新品種哺育單倍體育種：ａ過程:植株(AaBb)通過減數(shù)分裂得到花粉（ＡＢ、Ａｂ、aB、aｂ四種類型)；對花粉進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)(技術(shù)是植物組織培養(yǎng));得到單倍體植株；對其幼苗時期進(jìn)行秋水仙素解決；得到了正常的純合二倍體植株（AAＢB、AAｂb、aａBＢ、aａbb四種類型)。b優(yōu)點(diǎn):明顯縮短育種年限C突變體運(yùn)用：在組織培養(yǎng)中會出現(xiàn)突變體,通過從有用的突變體中選育出新品種(如篩選抗病、抗鹽、含高蛋白的突變體)D細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn):通過可以產(chǎn)生對人們有利的產(chǎn)物的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng),從而讓它們可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞產(chǎn)物。(3）地位：是哺育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細(xì)胞雜交哺育植物新品種的最后一道工序。3．植物體細(xì)胞雜交技術(shù)(1)過程:注意：核融合標(biāo)志原生質(zhì)融合結(jié)束再生壁形成標(biāo)志著雜種細(xì)胞形成雜種植株形成標(biāo)志著植物體細(xì)胞雜交技術(shù)結(jié)束目的：為了獲得雜種植株原理：膜的流動性和細(xì)胞全能性(2)誘導(dǎo)融合的方法:物理法涉及離心、振動、電刺激等。化學(xué)法一般是用聚乙二醇（PEG)作為誘導(dǎo)劑。(3）意義：克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙。(二)動物細(xì)胞工程１.動物細(xì)胞培養(yǎng)（1）概念:動物細(xì)胞培養(yǎng):動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細(xì)胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和繁殖。原代培養(yǎng)定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)定義:當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處在接觸克制后,用胰蛋白酶解決,使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi),這個過程稱傳代培養(yǎng)．(分瓶培養(yǎng)的過程）細(xì)胞株:傳代細(xì)胞一般能傳到40-５0代,遺傳物質(zhì)一般不會發(fā)生改變，叫細(xì)胞株細(xì)胞系:傳代50代以后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài),部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變,能連續(xù)傳代,獲得不死性,叫細(xì)胞系。細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn),失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。(２）動物細(xì)胞培養(yǎng)的流程：取動物組織塊(動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶解決分散成單個細(xì)胞→制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細(xì)胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶解決分散成單個細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。(3)細(xì)胞貼壁和接觸克制：懸液中分散的細(xì)胞不久就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。細(xì)胞數(shù)目不斷增多，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面互相克制時,細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸克制。（４）原理:細(xì)胞增殖（5)動物細(xì)胞培養(yǎng)需要滿足以下條件①無菌、無毒的環(huán)境:培養(yǎng)液應(yīng)進(jìn)行無菌解決。通常還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素,以防培養(yǎng)過程中的污染。此外，應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，防止代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身導(dǎo)致危害。②營養(yǎng)：合成培養(yǎng)基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。③溫度:適宜溫度:哺乳動物多是36.5℃+0.5℃;pH：④氣體環(huán)境:(5）動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質(zhì)、培養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究的各種細(xì)胞。2.動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物（1)哺乳動物核移植可以分為胚胎細(xì)胞核移植（比較容易)和體細(xì)胞核移植（比較難)。(2）選用去核卵(母)細(xì)胞的因素：卵（母)細(xì)胞比較大,容易操作；卵(母)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)多，營養(yǎng)豐富。卵母細(xì)胞培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期(3）體細(xì)胞核移植的大體過程是：(右圖)核移植胚胎移植（4)體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用:①加速家畜遺傳改良進(jìn)程,促進(jìn)良畜群繁育；②保護(hù)瀕危物種,增大存活數(shù)量;③生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白;④作為異種移植的供體；⑤用于組織器官的移植等。(5)體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題：克隆動物存在著健康問題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等。3.動物細(xì)胞融合（1)動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。融合后形成的具有本來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。(2）動物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同,誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似，常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。(3)動物細(xì)胞融合的意義:克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種哺育的重要手段。（４）原理：膜的流動性（5）為了獲得雜交細(xì)胞(6）動物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較:比較項(xiàng)目細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)手段用法植物體細(xì)胞雜交細(xì)胞膜的流動性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動，聚乙二醇等試劑誘導(dǎo)克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，獲得雜種植株動物細(xì)胞融合細(xì)胞膜的流動性使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合除應(yīng)用植物細(xì)胞雜交手段外，再加滅活的病毒誘導(dǎo)制備單克隆抗體的技術(shù)之一4．單克隆抗體（1)抗體：一個Ｂ淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。(2)單克隆抗體的制備過程:注入小鼠注入小鼠細(xì)胞融合分離抗原注入小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體(3)雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn):既能大量繁殖,又能產(chǎn)生專一的抗體。(4）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng),靈敏度高，并能大量制備。(５）單克隆抗體的作用:①作為診斷試劑:準(zhǔn)確辨認(rèn)各種抗原物質(zhì)的細(xì)微差異,并跟一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速的優(yōu)點(diǎn)。②用于治療疾病和運(yùn)載藥物：重要用于治療癌癥治療，可制成“生物導(dǎo)彈”，也有少量用于治療其它疾病。專題三：胚胎工程１、精子的發(fā)生大體可以分為三個階段：精原細(xì)胞↓有絲分裂分裂,發(fā)生在睪丸曲細(xì)精管。精原細(xì)胞（部分精原細(xì)胞仍然保持為精原細(xì)胞)↓滋長，完畢ＤNA復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì)合成,即進(jìn)行染色體復(fù)制復(fù)制。初級精母細(xì)胞（開始減數(shù)分裂分裂）由中心體發(fā)育_____________↓減I分裂_____________高爾基體次級精母細(xì)胞高爾基體↓減Ⅱ分裂頭細(xì)胞核精（子）細(xì)胞頭細(xì)胞核_________↓這是精子形成_________線粒體鞘線粒體的第三個階段：線粒體鞘線粒體精子精細(xì)胞精子由細(xì)胞質(zhì)的其他部分發(fā)育２、卵子形成:⑴胚胎在性別分化以后，雌性胎兒卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞，通過有絲分裂,不斷增長數(shù)量,并經(jīng)DNA復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì)合成,即復(fù)制，滋長，成為初級卵母細(xì)胞細(xì)胞,這個細(xì)胞被卵泡細(xì)胞包圍，成為卵泡。即雌性胎兒在出生時,已經(jīng)準(zhǔn)備好了所有的初級卵母細(xì)胞(卵泡)。初級卵母細(xì)胞⑵排卵：是指卵子從卵泡中排出，排出時是初級卵母細(xì)胞細(xì)胞（馬、犬）或者是次級卵母細(xì)胞細(xì)胞（豬、羊）。初級卵母細(xì)胞⑶卵子形成過程中的減數(shù)分裂：減數(shù)第一次分裂在排卵前后完畢,產(chǎn)生一個次級卵母細(xì)胞和第一極體,進(jìn)入輸卵管，減數(shù)第二次分裂在輸卵管過程中完畢,標(biāo)志是:在的間隙可以觀測到二個極體的時候。卵黃膜透明帶放射冠卵黃膜透明帶放射冠3、受精作用⑴準(zhǔn)備階段：①精子準(zhǔn)備:精子必需在雌性生殖道中運(yùn)營一段時間，稱精子獲能。在體外受精操作時要人工進(jìn)行。②卵子準(zhǔn)備：排卵時排出的是初級卵母細(xì)胞