天然藥物分離技術(shù)及結(jié)構(gòu)表征3-2

天然藥物分離技術(shù)及結(jié)構(gòu)表征一、經(jīng)典分離技術(shù)

二、色譜分離技術(shù)

三、大孔樹脂分離技術(shù)四、膜分離技術(shù)五、分子蒸餾技術(shù)

第三講

植物化學(xué)成分的分離

一、大孔吸附樹脂色譜的概念以大孔吸附樹脂為吸附劑和分子篩應(yīng)用的柱色譜分離形式為大孔吸附樹脂色譜。二、大孔吸附樹脂色譜原理大孔吸附樹脂色譜是結(jié)合吸附性和分子篩性兩種原理進(jìn)行物質(zhì)分離的。吸附性主要來源于范德華引力和氫鍵作用力，分子篩性來源于大孔樹脂的多孔性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的滲透和過濾作用。被分離的成分根據(jù)其分子的大小不同和吸附力的差異而分離。

第三章大孔樹脂分離技術(shù)三、大孔吸附樹脂色譜基本構(gòu)成要素大孔吸附樹脂的基本構(gòu)成要素:有固定相、流動(dòng)相以及被分離成分。1.固定相（1）種類分為非極性、中等極性、極性和強(qiáng)極性四類。（2）性質(zhì)為大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，在溶劑中體積會(huì)發(fā)生膨脹。（3）根據(jù)被分離成分的極性和分子大小來選擇具有不同極性大小的大孔吸附樹脂，以及決定大孔吸附樹脂體積膨脹大小不同的溶劑。如分離大分子的物質(zhì)選擇能使大孔吸附樹脂體積膨脹大的溶劑；反之，選用使其體積膨脹小的溶劑。

2.流動(dòng)相（1）種類常用的有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）選用非極性大孔吸附樹脂選擇流動(dòng)相的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)；極性大孔吸附樹脂選擇流動(dòng)相的極性越大，洗脫能力越強(qiáng)。四、大孔吸附樹脂的類型

1.非極性吸附樹脂：為苯乙烯(二乙烯苯聚合物，也稱芳香族吸附劑。此類吸附樹脂品種較多，如南開大學(xué)的上海試劑廠的2.中等極性吸附樹脂：為聚丙烯酸酯型聚合物，以多功能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，也稱脂肪族吸附劑，如3.極性吸附樹脂：含硫氧、酰胺等基團(tuán)4.強(qiáng)極性吸附樹脂：含氨基、吡啶、氧化氮等極性基團(tuán)

國(guó)外大孔吸附樹脂性能表五、大孔吸附樹脂色譜的操作技術(shù)1.樹脂預(yù)處理將新購(gòu)樹脂用丙酮加熱回流提取以去除雜質(zhì)，并用水和乙醇浸泡過夜待用的過程。2.裝柱將浸泡過夜的樹脂用濕法裝柱，然后用95%的乙醇流洗柱床，至流出液與水混合無白色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味。3.藥液的上柱吸附

(1)藥液上柱前的預(yù)處理

。(2)泄漏曲線與吸附容量的考察

薄層檢測(cè)斑點(diǎn)峰面積樹脂吸附容量=泄露點(diǎn)前上柱樣品體積（ml）X樣品濃度（mg·L-1);(3)上柱工藝條件的篩選影響樹脂吸附性能的因素有諸多方面，其中最基本的是樹脂自身因素，包括樹脂的骨架結(jié)構(gòu)、功能基性質(zhì)及其極性等。此外，樣品pH值、濃度、吸附柱徑高比及上樣流速等條件均不同程度地影響樹脂的吸附性能。①上樣溶液的pH值上樣溶液pH值對(duì)吸附和分離效果至關(guān)重要，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靈活改變?nèi)芤簆H值，可使提純工作達(dá)到理想效果。不同pH值的吸附量和產(chǎn)品中黃酮含量比較

②藥液濃度、流速及樹脂柱徑高比等因素也直接影響了大孔吸附樹脂的吸附性能。4.樹脂的解吸分離

由于樹脂極性強(qiáng)弱不同，解吸分離時(shí)對(duì)洗脫劑極性大小的要求也不同。洗脫劑選擇基本要求依據(jù)“相似相溶”原理。

(1)非極性大孔樹脂，洗脫劑極性越小，其洗脫能力越強(qiáng)；(2)對(duì)于中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物來說，則用極性較大的溶劑洗脫較為合適。洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，根據(jù)吸附力強(qiáng)弱選用不同的洗脫劑及濃度。實(shí)驗(yàn)研究具體操作方法為：解吸時(shí)，通常先用水，繼而以醇-水洗脫，逐步加大醇的濃度，同時(shí)配合適當(dāng)理化反應(yīng)和薄層層析（如硅膠薄層層析、紙層析、聚酰胺薄層層析及HPLC等）作指導(dǎo)。解吸效果的評(píng)價(jià)：根據(jù)洗脫曲線，選擇洗脫峰最集中的條件，如喜樹堿用不同洗脫劑的洗脫曲線。5.樹脂的再生

通常，當(dāng)樹脂使用一定周期后吸附能力要降低，或當(dāng)樹脂受污染嚴(yán)重時(shí)，均應(yīng)強(qiáng)化再生。一般用無水乙醇或95%乙醇洗脫至無色后，樹脂柱即已再生。然后用大量水洗去醇，可用于相同植物成分的分離。

若樹脂顏色變深，可試用稀堿或稀酸溶液清洗，最后水洗至中性。

六、影響樹脂純化效果的因素及條件（1）樹脂性質(zhì)如前所述，樹脂的理化性質(zhì)對(duì)吸附效果的影響很大，一般要求樹脂的吸附容量大、吸附速度快和機(jī)械強(qiáng)度好。由于樹脂的孔度、孔徑、比表面積及極性不同，故性質(zhì)也不同，使用時(shí)必須根據(jù)情況加以選擇。凡要吸附分子量小的物質(zhì)，則選擇比表面積高及孔徑較小的吸附劑。（2）藥液pH值由于pH值影響某些藥物的解離度，亦即影響該化合物與溶劑的親和力，從而影響到被大孔樹脂吸附的難易程度。一般情況下，酸性物質(zhì)應(yīng)在酸性溶液中吸附，堿性物質(zhì)在堿性溶液中吸附。（3）藥液濃度大孔樹脂的吸附量與藥液濃度符合經(jīng)典吸附式，即藥液濃度增加，吸附量增加。但藥液濃度增加有一定限度，即不能超過樹脂的吸附容量。（4）溶劑被吸附的化合物在溶劑中的溶解度對(duì)吸附性能有一定的影響。通常，一種物質(zhì)在某種溶劑中溶解度越大，樹脂對(duì)該物質(zhì)的吸附力就越小。如有機(jī)酸鹽或生物堿鹽在水中的溶解度很大，樹脂對(duì)其吸附能力就弱。（5）上柱藥液的溫度上柱藥液的溫度升高，樹脂的比上柱量下降，說明中藥成分在樹脂上的吸附過程為一放熱反應(yīng)。低溫有利于樹脂吸附容量的提高，溫度太高會(huì)影響吸附效果，經(jīng)實(shí)踐證明，室溫對(duì)試驗(yàn)幾乎無影響，超過50℃時(shí)，吸附量明顯下降，而在一定的溫度范圍內(nèi)，上柱藥液的溫度越高，洗脫效果越好，故應(yīng)注意上柱藥液溫度。（6）鹽濃度無機(jī)鹽的加入降低了吸附質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的溶解度，從而有利于大孔樹脂的吸附。有人通過靜態(tài)吸附量的試驗(yàn)比較，認(rèn)為無機(jī)鹽的濃度為35g·L-1時(shí)，大孔樹脂對(duì)人參總皂苷的吸附能力最強(qiáng)。（7）樹脂柱徑高比樹脂柱內(nèi)徑與其柱高的比例也是影響樹脂吸附效果的因素之一。合適的徑高比可為分離提供較高的柱效，從而更有利于大孔樹脂的吸附與分離。（8）樹脂柱的清洗化合物經(jīng)樹脂吸附后在樹脂表面或內(nèi)部殘留有許多非極性物質(zhì)或吸附性雜質(zhì)成分，必須在清洗過程中洗除，非吸附性成分一般用水即可洗除，而吸附性雜質(zhì)根據(jù)情況可用一定濃度的酸液或堿液除去,一般情況下洗至近無色即可。（9）洗脫液的選擇及解吸根據(jù)被吸附物的性質(zhì)及吸附環(huán)境選擇適宜的洗脫液進(jìn)行洗脫和解吸。常用的方法是用低級(jí)醇、酮或其水溶液解吸，如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、水等。所選用的溶劑應(yīng)符合兩種要求：其一要求溶劑應(yīng)能使大孔網(wǎng)狀吸附劑溶脹，這樣可減弱溶質(zhì)與吸附劑之間的吸附力；其二則要求所選用的溶劑應(yīng)容易溶解吸附物。因?yàn)榻馕鼤r(shí)不僅需克服吸附力，而且當(dāng)溶劑分子擴(kuò)散到吸附中心后，應(yīng)能使溶質(zhì)很快溶解。對(duì)弱酸性物質(zhì)可用堿來解吸，對(duì)弱堿性物質(zhì)則宜在酸性溶劑中解吸。吸附若在高濃度鹽類溶液中進(jìn)行時(shí)，則常常僅用水洗就能解吸?！緦?shí)例1】三棵針生物堿的提取【實(shí)例2】茶多酚提取分離工藝第四章膜分離技術(shù)第一節(jié)簡(jiǎn)介一、膜分離原理膜分離過程是以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動(dòng)力（如壓力差、濃度差、電位差等）時(shí)，原料側(cè)組分選擇性地透過膜，以達(dá)到分離、提純的目的。膜分離技術(shù)有微濾、超濾、納濾、反滲透、電滲析等其中，反滲透、納濾、超濾、微濾相當(dāng)于過濾技術(shù)，用以分離含溶解的溶質(zhì)或懸浮微粒的液體。與傳統(tǒng)過濾的不同在于膜可以在分子范圍內(nèi)進(jìn)行分離，溶劑或小分子溶質(zhì)透過膜，顆粒、大分子溶質(zhì)被膜截留。電滲析用的是荷電膜，在電場(chǎng)力的推動(dòng)下，用以從水溶液中脫除離子，主要用于苦咸水的脫鹽。納濾適宜于分離相對(duì)分子質(zhì)量在200、分子大小約為1nm的溶解組分，納濾膜具有離子選擇性，在生物技術(shù)工程中納濾用來濃縮及脫鹽，反滲透用于制水。二、膜的分類與特征膜就結(jié)構(gòu)分為對(duì)稱膜、非對(duì)稱膜及復(fù)合膜。按其大小分為多孔膜、致密膜（無孔膜），多孔膜主要用于超濾、微濾和滲折過程；電中性的無孔膜主要用于反滲透、滲透汽化和氣體滲透過程；而荷電的無孔膜則用于納濾和電滲析過程。按材料分為有機(jī)膜與無機(jī)膜，有機(jī)膜主要為高分子化合物，應(yīng)用最多最早的是纖維素類，另外有聚酰胺類、芳香雜環(huán)類、聚砜類、聚烯烴類、硅橡膠類、含氟高分子等；無機(jī)膜因其突出的特點(diǎn)（高熱穩(wěn)定性、耐化學(xué)侵蝕、無老化問題、使用壽命長(zhǎng)、可反向沖洗等）受到了越來越多的重視，其中部分產(chǎn)品已在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。三、膜分離技術(shù)的特點(diǎn)①操作溫度低，適用于熱敏性物質(zhì)的分離、分級(jí)、濃縮與富集。②無需外加其他物質(zhì)，節(jié)約能源，保護(hù)環(huán)境。③選擇性高，藥效成分回收率和非藥效成分去除率高。④分離與濃縮同時(shí)實(shí)現(xiàn)，濃縮率高。⑤適用范圍廣，不使用有機(jī)溶劑及化學(xué)處理，可保持中藥方劑原方配伍的特點(diǎn)。⑥可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，易與其他過程偶合，裝置和操作簡(jiǎn)單，周期短，易放大。⑦膜分離技術(shù)由于膜材料價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本較高，且生產(chǎn)中需要較大的壓力設(shè)備，使其在工業(yè)中的應(yīng)用受到一定限制。第二節(jié)膜分離技術(shù)用于中藥有效部位提取的原理和依據(jù)

中草藥的化學(xué)成分十分復(fù)雜，通常含有生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、酚類、皂苷、甾體、萜類化合物以及蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)、鞣質(zhì)、糖類、淀粉、纖維素、無機(jī)鹽等。其分子量的分布很寬，為幾十至幾百萬道爾頓。部分中藥中所含的主要成分的分子量范圍第五章分子蒸餾技術(shù)分子蒸餾是在0.01-1.33Pa(1x10-4—1x10-2mmHg)的高真空下進(jìn)行的一種特殊的蒸餾技術(shù)，在此條件下，蒸發(fā)面和冷凝面的間距小于或等于被分離物料的蒸氣分子的平均自由程，所以又叫短程蒸餾。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于石油化工、食品香料等領(lǐng)域。本章將簡(jiǎn)要介紹分子蒸餾技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其在中藥和天然藥物分離中的應(yīng)用。第一節(jié)分子蒸餾的基本原理一、分子運(yùn)動(dòng)自由程分子碰撞：分子與分子之間存在著相互作用力。當(dāng)兩個(gè)分子離得較遠(yuǎn)時(shí)，分子之間的作用力表現(xiàn)為吸收力，但當(dāng)兩分子接近到一定程度后，分子之間的作用力會(huì)改變?yōu)榕懦饬?，并隨其接近程度的增加，排斥力迅速增加。當(dāng)兩分子接近到一定程度時(shí)，排斥力的作用使兩分子分開，這種由接近而至排斥分離的過程就是分子的碰撞過程。

分子有效直徑：分子在碰撞過程中，兩分子質(zhì)心的最短距離，即發(fā)生斥離的質(zhì)心距離。

分子運(yùn)動(dòng)自由程：一個(gè)分子相鄰兩次分子碰撞之間所走的路程。二、分子運(yùn)動(dòng)平均自由程任一分子在運(yùn)動(dòng)過程中都在變化自由程，而在一定的外界條件下，不同物質(zhì)的分子其自由程各不相同。就某一種分子來說，在某時(shí)間間隔內(nèi)自由程的平均值稱為平均自由程。由熱力學(xué)原理可推導(dǎo)出：式中，λm是平均自由程；d是分子有效直徑；p是分子所處環(huán)境壓強(qiáng)；T是分子所處環(huán)境溫度；k是波爾茲曼常數(shù)。三、分子蒸餾的基本原理根據(jù)分子運(yùn)動(dòng)理論，液體混合物的分子受熱后運(yùn)動(dòng)會(huì)加劇，當(dāng)接受到足夠能量時(shí)，就會(huì)從液面逸出而成為氣相分子。隨著液面上方氣相分子的增加，有一部分氣體就會(huì)返回液體。在外界條件保持恒定情況下，最終會(huì)達(dá)到分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡。根據(jù)分子平均自由程公式可知，不同種類的分子，由于其分子有效直徑不同，故其平均自由程也不同，即從統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)看，不同種類分子逸出液面后不與其他分子碰撞的飛行距離是不相同的。分子蒸餾的分離作用就是利用液體分子受熱會(huì)從液面逸出，而不同種類分子逸出后其平均自由程不同的這一性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。分子蒸餾技術(shù)的核心是分子蒸餾裝置。為達(dá)到分離的目的，首先對(duì)液體混合物進(jìn)行加熱，能量足夠的分子逸出液面，輕分子的平均自由程大，重分子的平均自由程小，若在離液面小于輕分子的平均自由程而大于重分子平均自由程處設(shè)置一捕集器，使得輕分子不斷被捕集，從而破壞了輕分子的動(dòng)態(tài)平衡而使混合液中的輕分子不斷逸出，而重分子因達(dá)不到捕集器很快趨于動(dòng)態(tài)平衡，不再?gòu)幕旌弦褐幸莩觯@樣，液體混合物便達(dá)到了分離的目的。

第二節(jié)分子蒸餾技術(shù)的特點(diǎn)鑒于分子蒸餾在原理上根本區(qū)別于常規(guī)蒸餾，因而它具備許多常規(guī)蒸餾無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。（1）操作溫度低:常規(guī)蒸餾是靠不同物質(zhì)的沸點(diǎn)差進(jìn)行分離，而分子蒸餾是靠不同物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)自由程的差別進(jìn)行分離，因此，后者是在遠(yuǎn)離（遠(yuǎn)低于）沸點(diǎn)下進(jìn)行操作的。（2）蒸餾壓強(qiáng)低:由于分子蒸餾裝置獨(dú)特的結(jié)構(gòu)形式，其內(nèi)部壓強(qiáng)極小，可以獲得很高的真空度。同時(shí)，由分子運(yùn)動(dòng)自由程公式可知，要想獲得足夠大的平均自由程，可以通過降低蒸餾壓強(qiáng)來獲得，一般為10-1Pa的數(shù)量級(jí)。從以上兩點(diǎn)可知，盡管常規(guī)真空蒸餾也可采用較高的真空度，但由于其結(jié)構(gòu)上的制約（特別是板式塔或填料塔），其阻力較分子蒸餾裝置大得多，因而真空度上不去，加之在沸點(diǎn)以上操作，所以其操作溫度比分子蒸餾高得多。如某液體混合物在真空蒸餾時(shí)的操作溫度為260℃，而分子蒸餾僅為150℃。（3）受熱時(shí)間短:鑒于分子蒸餾是基于不同物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)自由程的差別而實(shí)行分離的，因而受加熱面與冷凝面的間距要小于輕分子的運(yùn)動(dòng)自由程（即距離很短），這樣由液面逸出的輕分子幾乎未碰撞就到達(dá)冷凝面，所以受熱時(shí)間很短。假定真空蒸餾受熱時(shí)間為1h，則分子蒸餾僅用十幾秒。（4）分離程度高:分子蒸餾常常用來分離常規(guī)蒸餾不易分開的物質(zhì)，然而就兩種方法均能分離的物質(zhì)而言，分子蒸餾的分離程度更高。分子蒸餾的揮發(fā)度一般用下式表示：M1為輕組分分子量；M2為重組分分子量。而常規(guī)蒸餾的相對(duì)揮發(fā)度：在ρ1/ρ2相同的情況下，重組分的分子量M2比輕組分的分子量M1大，所以αr比α大。這就表明分子蒸餾較常規(guī)蒸餾更易分離，且M1、M2的差別越大則分離程度越高。（5）不可逆性普通蒸餾是蒸發(fā)與冷凝的可逆過程，液相和氣相間可以形成互相平衡狀態(tài)。而分子蒸餾過程中，從蒸發(fā)表面逸出的分子直接飛射到冷凝面上，中間不與其他分子發(fā)生碰撞，理論上沒有返回蒸發(fā)面的可能性，所以，分子蒸餾是不可逆的。

（6）沒有沸騰、鼓泡現(xiàn)象普通蒸餾有鼓泡、沸騰現(xiàn)象，分子蒸餾是液層表面上的自由蒸發(fā)，在低壓力下進(jìn)行，液體中無溶解的空氣，因此在蒸餾過程中不能使整個(gè)液體沸騰，沒有鼓泡現(xiàn)象。（7）可進(jìn)行多級(jí)分子蒸餾對(duì)于較為復(fù)雜的混合物的分離提純，可進(jìn)行多級(jí)分子蒸餾，產(chǎn)率較高。（8）與其他新技術(shù)聯(lián)用分子蒸餾設(shè)備可與超臨界流體萃取技術(shù)和膜分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。第三節(jié)分子蒸餾設(shè)備完整的分子蒸餾系統(tǒng)主要包括：脫氣系統(tǒng)、進(jìn)料系統(tǒng)、分子蒸餾器、加熱系統(tǒng)、真空冷卻系統(tǒng)、接收系統(tǒng)和控制系統(tǒng)。1—變速機(jī)組；2—刷膜蒸發(fā)器缸；3—重組分接收瓶；4—輕組分接收瓶；5—恒溫水泵；6—導(dǎo)熱油爐；7—旋轉(zhuǎn)真空計(jì)；8—液氮冷阱；9—油擴(kuò)散泵；10—導(dǎo)熱油控溫計(jì)；11—熱油泵；12—前級(jí)真空泵；13—刮膜轉(zhuǎn)子；14—進(jìn)料閥；15—原料瓶；16—冷凝柱。分子蒸餾器是整個(gè)分子蒸餾系統(tǒng)的核心部分，在分子蒸餾過程中起著決定作用。

第五節(jié)分子蒸餾技術(shù)在中藥和天然藥物中的應(yīng)用一、應(yīng)用優(yōu)勢(shì)