第二章 比色分析與分光光度分析

第二章比色分析與分光光度分析KMnO4水溶液呈深紫色，K2CrO4溶液呈黃色，CuSO4溶液呈藍(lán)色……當(dāng)這些有色物質(zhì)溶液的濃度發(fā)生變化時(shí)，溶液顏色的深淺也隨之改變，濃度越大，顏色越深----可以通過(guò)比較溶液顏色的深淺來(lái)測(cè)定物質(zhì)的含量?！?-1吸光光度法這種基于比較溶液顏色的深淺進(jìn)行定量分析的方法，稱(chēng)為目視比色法。隨著近代測(cè)試儀器的發(fā)展，目前已普遍采用分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析，應(yīng)用分光光度計(jì)的分析方法稱(chēng)為分光光度法。通過(guò)深入研究，人們發(fā)現(xiàn)：

吸光光度法是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。一、吸光光度法定義吸光光度法比色分析法——目測(cè)

物質(zhì)呈現(xiàn)不同的顏色其本質(zhì)是對(duì)光的選擇性吸收；顏色深淺隨濃度而變化是對(duì)光的吸收程度不同。

1.靈敏度高：常用于測(cè)定試樣中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（10-2～10-8）的微量或痕量組分。

二、吸光光度法特點(diǎn)2.準(zhǔn)確度高：一般分光光度法的相對(duì)誤差2～5％，能夠滿足微量組分的測(cè)定要求。

3.儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速4.應(yīng)用廣泛

在化工、醫(yī)藥、冶金、環(huán)境保護(hù)、地質(zhì)等諸多領(lǐng)域已成為必不可少的測(cè)試手段之一。

幾乎所有的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物都能直接或間接用吸光光度法測(cè)定?！?-2吸光光度法的基本原理一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收二、光吸收基本定律—Lambert-Beer定律三、朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用—溶液濃度的測(cè)定方法四、偏離朗伯—比耳定律的原因內(nèi)容提要1.光的基本性質(zhì)光是一種電磁波射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收電磁波譜2.關(guān)于光的幾個(gè)術(shù)語(yǔ)可見(jiàn)光：人眼能感覺(jué)到的那一小段光，波長(zhǎng)范圍約400～760nm

單色光：?jiǎn)我徊ㄩL(zhǎng)的光組成，單色光其實(shí)是一種理想的“單色”，實(shí)際上含有少量其它波長(zhǎng)的色光復(fù)合光：由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光互補(bǔ)色光：兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合可得到白光，這兩種單色光稱(chēng)為互補(bǔ)色光。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠綠藍(lán)橙紅藍(lán)綠圖中處于對(duì)角線上的兩種單色光為互補(bǔ)色光。例如藍(lán)色光和黃色光、綠色光和紫紅色光互補(bǔ)等3.光的選擇性吸收和溶液的顏色

一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色，與入射光組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān),而溶液呈現(xiàn)不同的顏色是由于溶液中的吸光質(zhì)點(diǎn)(離子或分子)選擇性地吸收某種顏色的光而引起的。

常見(jiàn)的有下列三種情況：③如果對(duì)某種色光產(chǎn)生選擇性吸收，則溶液呈現(xiàn)透射光的顏色，即溶液呈現(xiàn)的是它吸收光的互補(bǔ)色光的顏色。如硫酸銅溶液選擇性地吸收了白色光中的黃色光，所以呈現(xiàn)藍(lán)色。①當(dāng)白光通過(guò)某一均勻溶液時(shí)，如果各種波長(zhǎng)光幾乎全部被吸收，則溶液呈黑色。②如果入射光全部透過(guò)（不吸收），則溶液無(wú)色透明。溶液的顏色與光吸收的關(guān)系完全吸收完全透過(guò)吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光物質(zhì)呈現(xiàn)顏色與吸收光波長(zhǎng)的關(guān)系見(jiàn)下表。不同顏色的可見(jiàn)光波長(zhǎng)及其互補(bǔ)光紅650～760綠藍(lán)橙610～650藍(lán)黃580～610紫黃綠560～580紅紫綠500～560紅藍(lán)綠490～500橙綠藍(lán)480～490黃藍(lán)450～480黃綠紫400～450互補(bǔ)光顏色/nm藍(lán)綠

互補(bǔ)色光和各種顏色光的波長(zhǎng)范圍，可作為光度測(cè)定時(shí)選擇測(cè)量波長(zhǎng)的參考4.吸收曲線

任何一種溶液對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度是不一樣的。

若以不同波長(zhǎng)的光照射某一溶液，并測(cè)量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)光的吸收程度（即吸光度A），以吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，所得A-λ曲線，稱(chēng)為吸收曲線。它更清楚地描述了物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。四種不同濃度KMnO4溶液的吸收曲線300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350Cr2O72-、MnO4-的吸收曲線③同一物質(zhì)不同濃度的溶液，在一定波長(zhǎng)處吸光度隨溶液濃度的增加而增大

——定量分析的依據(jù)②同一物質(zhì)的吸收曲線相似，max不變；不同物質(zhì)吸收曲線的形狀和max均不相同，據(jù)此可作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)

定量分析時(shí)，在max處測(cè)定A，其靈敏度最高，因此吸收曲線是吸光光度法選擇測(cè)量波長(zhǎng)的重要依據(jù)。從圖中可以看出：①吸光度最大處的波長(zhǎng)稱(chēng)為最大吸收波長(zhǎng)，用λmax表示，例如的KMnO4溶液的

λmax

=525nm。注意！二、光吸收基本定律:Lambert-Beer定律當(dāng)一束平行單色光，通過(guò)一均勻的溶液后，光的強(qiáng)度會(huì)減弱。I0=Ia+It入射光強(qiáng)度吸收光強(qiáng)度透過(guò)光強(qiáng)度1.透光度T

（透射比）Transmittance定義透光度：T取值為0.0~1.0全部吸收~~~~全部透射A=lg(1/T)=-lgT2.吸光度A(Absorbance）A取值為0.0~∞全部透射~~~全部吸收二者關(guān)系為：定義吸光度：3.光吸收基本定律——朗伯-比爾定律

朗伯和比爾分別研究了吸光度與液層厚度和吸光度與濃度之間的定量關(guān)系，合稱(chēng)朗伯-比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：吸光度吸收層厚度(cm)吸光質(zhì)點(diǎn)濃度A=lg(I0/It)=kbc

物理意義:

當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻、透明的吸光介質(zhì)時(shí)，其吸光度與吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比——吸光光度法定量分析的理論基礎(chǔ)K的取值與濃度的單位有關(guān)K

比例常數(shù)入射光波長(zhǎng)物質(zhì)的性質(zhì)溫度4.吸光系數(shù)與摩爾吸光系數(shù)A=kbc①當(dāng)c的單位為g·L-1時(shí)，比例常數(shù)用a表示，稱(chēng)為吸光系數(shù)

A＝abρ②當(dāng)c的單位用mol·L-1時(shí)，比例常數(shù)用表示,稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)

A＝bca

的單位:L·g-1·cm-1的單位:L·mol-1·cm-1A＝bc

或A＝a

bρ

以A為縱坐標(biāo)，濃度c(ρ)為橫坐標(biāo)，繪制的A-c(ρ)曲線稱(chēng)為工作曲線。三、朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用—溶液濃度的測(cè)定方法01.02.03.04.0ρ(mg/mL)A。。。。0.800.600.400.200.00工作曲線法：

測(cè)定試樣中某組分含量時(shí)，先配制一系列該組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所需條件顯色后，在選定的波長(zhǎng)和吸收池厚度下，分別測(cè)定它們的吸光度A。

在相同條件下測(cè)定樣品溶液的吸光度，從工作曲線上查得樣品溶液的濃度，進(jìn)而計(jì)算試樣中待測(cè)組分的含量。01.02.03.04.0ρ(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx樣品的測(cè)定四、偏離朗伯—比耳定律的原因

用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液濃度較高時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象稱(chēng)為對(duì)朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素。1.物理性因素

吸收定律成立的前提條件之一是入射光為單色光，但實(shí)際上難以獲得真正的純單色光。

在實(shí)際工作中，為了避免非單色光帶來(lái)的影響，一般選用峰值波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶，而復(fù)合光可導(dǎo)致對(duì)朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。選用峰值波長(zhǎng)，也可以得到較高的靈敏度。2.化學(xué)性因素

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí)，使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。當(dāng)溶液濃度c>10-2mol/L時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對(duì)光的吸收。故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

2CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時(shí)溶液pH對(duì)測(cè)定有重要影響?！?-3顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇

可見(jiàn)光區(qū)的吸光光度分析，首先要利用顯色反應(yīng)將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)，然后進(jìn)行測(cè)定。顯色劑：將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)的化學(xué)試劑顯色反應(yīng)：M+RMR被測(cè)組分有色物質(zhì)顯色劑M+RMR一、對(duì)顯色反應(yīng)的要求1.選擇顯色反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮的因素靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收，兩種有色物最大吸收波長(zhǎng)之差：“對(duì)比度”，要求△>60nm。2.配位顯色反應(yīng)

當(dāng)金屬離子與有機(jī)顯色劑形成配合物時(shí)，通常會(huì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷，產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外—可見(jiàn)吸收光譜。3.氧化還原顯色反應(yīng)

某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見(jiàn)光區(qū)能強(qiáng)烈吸收，可利用氧化還原反應(yīng)對(duì)待測(cè)離子進(jìn)行顯色后測(cè)定。

例如：鋼中微量錳的測(cè)定，Mn2＋不能直接進(jìn)行光度測(cè)定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋

+10SO42-＋16H+

將Mn2＋氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進(jìn)行測(cè)定。4.顯色劑

無(wú)機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過(guò)氧化氫等幾種。有機(jī)顯色劑：種類(lèi)繁多

偶氮類(lèi)顯色劑：本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對(duì)比度大等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。

三苯甲烷類(lèi)：鉻天青S、二甲酚橙等影響因素二、顯色條件的選擇M+RMROH-M（OH）nH+HnR顯色劑用量酸度溫度顯色時(shí)間溶劑溶液中共存離子1.顯色劑用量

為使顯色反應(yīng)完全，需加入過(guò)量的顯色劑，但有時(shí)顯色劑太多，引起副反應(yīng)，用量通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇。固定c(M)、pH，改變c（R）：c(R)c(R)c(R)2.顯色反應(yīng)酸度pH酸度對(duì)顯色反應(yīng)有影響，要控制合適的酸度，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。固定c(M)、c(R)，改變pH25℃50℃t/minA3.顯色溫度及顯色時(shí)間

顯色反應(yīng)要在合適的溫度下進(jìn)行；有的顯色反應(yīng)瞬間完成，有的需要放置一定時(shí)間。有的放置時(shí)間太長(zhǎng)不穩(wěn)定，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇。固定c(M)、c(R)、pH，改變溫度和時(shí)間

有時(shí)在顯色反應(yīng)中加入有機(jī)溶劑，可提高顯色反應(yīng)的靈敏度。4.溶劑5.溶液中共存離子的影響

共存離子有色或顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)干擾測(cè)定，需設(shè)法消除或提前分離之。三、共存離子干擾的消除1.加入掩蔽劑

選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測(cè)組分反應(yīng)；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測(cè)組分的測(cè)定。例：測(cè)定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為Fe(PO４)23-(無(wú)色)，消除Fe3+的干擾；又如用鉻天菁S光度法測(cè)定Al3+時(shí)，加入抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，消除Fe3+的干擾。2.選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)條件3.分離干擾離子四、測(cè)量條件的選擇

吸光度的測(cè)量：將被測(cè)溶液盛放在吸收池中，放入分光光度計(jì)光路中。如圖所示：MR吸收試樣中其他成分吸收溶劑和試劑吸收吸收池對(duì)光的反射和吸收A=lg(I0/It)

目的是為了消除由于比色皿、溶劑及試劑對(duì)入射光的反射和吸收等帶來(lái)的誤差。A（樣品）=A（MR）+A（干擾）+A（吸收池）A（參比）=A（干擾）+A（池）=0

為了使吸光度真正反映待測(cè)組分的濃度，需扣除非待測(cè)組分的影響——使用參比溶液

參比溶液：將不含待測(cè)離子的溶液或試劑加入一比色皿中，試液放入另一比色皿中，再調(diào)節(jié)儀器，使不含待測(cè)離子溶液處于T=100%（A=0）處，此種溶液為參比溶液。A（樣品）-A（參比）=

A（MR）=kbc

1.選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL(zhǎng)

一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長(zhǎng)。如果λmax處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長(zhǎng)。2.控制適宜的吸光度范圍

濃度測(cè)量值的相對(duì)誤差（Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)T的值也有關(guān)。應(yīng)控制A：0.2~0.8之間?？刂品椒ǎ?）控制溶液濃度

A>0.8時(shí)，稀釋后測(cè)量；A<0.2時(shí)，擴(kuò)大取樣量或濃縮后測(cè)量。2）控制液層厚度

A>0.8時(shí)，選擇光程小的吸收池；A<0.2時(shí)，選擇光程大的吸收池。

3.選擇合適的參比溶液

為什么需要使用參比溶液？

測(cè)得的吸光度真正反映待測(cè)溶液吸光強(qiáng)度。

參比溶液的選擇一般遵循以下原則：

⑴若僅待測(cè)組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，其它所加試劑均無(wú)吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；⑵若顯色劑或其它所加試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處略有吸收，而試液本身無(wú)吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；

⑶若待測(cè)試液在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，而顯色劑等無(wú)吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；

⑷若顯色劑、試液中其它組分在測(cè)量波長(zhǎng)處有吸收，則可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測(cè)組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。提高光度測(cè)定靈敏度和選擇性的途徑1.合成新的高靈敏度有機(jī)顯色劑2.采用分離富集和測(cè)定相結(jié)合3.采用三元(多元)配合物顯色體系

由一個(gè)中心金屬離子與兩種(或兩種以上)不同配位體形成的配合物，稱(chēng)為三元(多元)配合物。

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多元配合物顯色反應(yīng)具有很高的靈敏度，一方面是因?yàn)槎嘣浜衔锉绕湎鄳?yīng)的二元配合物分子截面積更大；另一方面是因?yàn)榈诙虻谌湮惑w的引入，可能產(chǎn)生配位體之間、配位體與中心金屬離子間的協(xié)同作用，使共軛π電子的流動(dòng)性和電子躍遷幾率增大。三元配合物主要類(lèi)型有：三元離子締合物、三元混配配合物、三元膠束(增溶)配合物。五、吸光度范圍的選擇

儀器光源不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)條件的偶然變動(dòng)、讀數(shù)精度變動(dòng)等都會(huì)帶來(lái)測(cè)量誤差。光度分析誤差化學(xué)因素儀器因素濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與T(或A)的關(guān)系：儀器讀數(shù)誤差對(duì)于給定的儀器，讀數(shù)誤差ΔT為一常數(shù)1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434實(shí)際工作中，應(yīng)控制T在15～65％,A在0.2～0.8之間(調(diào)c,b,)

因此，在不同的吸光度范圍內(nèi)儀器讀數(shù)對(duì)測(cè)定帶來(lái)不同程度的誤差?！?-4目視比色與分光光度計(jì)一、光度分析的幾種方法

用眼睛觀察比較標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液的顏色測(cè)其含量。比色管觀察方向1.目視比色法c4c3c2c1c1c2c3c4標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品

方法方便、靈敏，準(zhǔn)確度差。2.吸光光度法和分光光度計(jì)分光光度法的基本部件通過(guò)棱鏡或光柵得到一束近似的單色光波長(zhǎng)可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示721分光光度計(jì)（以后替換成本系722型）

可見(jiàn)分光光度計(jì)

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（1）分光光度計(jì)的主要部件光源：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠 的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。 可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置

光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示

2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2吸收池：(比色皿)用于盛待測(cè)及參比溶液。 可見(jiàn)光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池如何鑒別石英比色皿與玻璃比色皿1、把空比色皿放在儀器里面掃描，你會(huì)發(fā)現(xiàn)：在200－300nm之間有吸收的是玻璃比色皿，沒(méi)有吸收的就是石英比色皿，

2、樣品室不放置任何樣品，波長(zhǎng)設(shè)置250nm，調(diào)零。將比色皿被放置在樣品道，吸光值小于0.07Abs的是石英的，反之是玻璃的。553、比色皿上邊標(biāo)有字母Ｓ的是石英比色皿，另外最好在紫外區(qū)做對(duì)比，有吸收的為玻璃比色皿。4、根據(jù)阿基米德原理，測(cè)一下兩個(gè)比色皿的密度。5、紫外和可見(jiàn)用的比色皿是不同的，標(biāo)Q和S的都是石英的

，石英比色皿，紫外光區(qū)200-