一輪復(fù)習(xí)-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

課題2土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、基礎(chǔ)知識(shí)：1、尿素的利用尿素[CO(NH2)2]——重要的農(nóng)業(yè)氮肥。土壤中細(xì)菌將其分解為NH3才能被植物吸收利用。2、土壤中的細(xì)菌能利用尿素的原因:土壤中的尿素分解菌菌能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3再通過平板劃線法或稀釋涂布平板法對(duì)目的菌進(jìn)行分離和純化。3、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：

利用選擇培養(yǎng)基，人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，促進(jìn)目的菌株的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。15.0g瓊脂1.0g尿素(唯一N源)10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4篩選尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基：（下列物質(zhì)溶解后，定容至1000mL）4.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于具有運(yùn)動(dòng)性的細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要較高的細(xì)菌濃度；顯微鏡下難以觀察個(gè)體小的細(xì)菌；缺點(diǎn)：(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)(2)間接計(jì)數(shù)(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的菌落的平均數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果更接近真實(shí)值可將同一稀釋度的土壤稀釋液涂布到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，并求平均值。③由于菌落間有粘連，因此統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比實(shí)際的活菌數(shù)低。二、實(shí)驗(yàn)過程

（一）配制土壤溶液

1、土壤取樣：鏟去表層土取樣。2、將10g土樣溶于90mL無菌水，制成101的稀釋液。

（四）菌落鑒定（一）配制土壤溶液（二）系列稀釋（三）涂布平板與培養(yǎng)、觀察（二）樣品稀釋（酒精燈火焰旁進(jìn)行）（1）測(cè)細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液（2）測(cè)放線菌：一般用103、104、105稀釋液（3）測(cè)真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液原則：確保平板上的菌落數(shù)在30～300之間。（三）涂布平板與培養(yǎng)、觀察1、涂布：用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤鐾坎计桨澹ɑ鹧媾裕?、培養(yǎng)：細(xì)菌：30～37℃，1～2d;

放線菌:25～28℃,5～7d;

霉菌:25～28℃,3～4d.3、觀察：a.每24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目b.以“穩(wěn)定菌落”為觀察對(duì)象，防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而遺漏菌落。

（四）鑒定--鑒別培養(yǎng)基（不影響微生物的生存）

鑒定尿素分解菌的培養(yǎng)基---酚紅培養(yǎng)基

原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅CO(N