高效液相色譜方法

高效液相色譜方法及應(yīng)用液相色譜的發(fā)展史液相色譜的基本概念高效液相色譜的具體操作（Aglient1100）本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用HPLC的實(shí)驗(yàn)總結(jié)歷史回顧1906年，俄國(guó)植物學(xué)家Tswett（茨維特）用碳酸鈣作為吸附劑，分離干燥葉子的石油醚萃取物，發(fā)現(xiàn)三種顏色六條色帶，他把這種色帶稱為“色譜”；屬于液固色譜。1940年，Martin和Synge提出了液液分配色譜；1941年提出了氣相色譜可能性；1949年，Macllean制作薄層色譜板1952年，Martin和Synge發(fā)展了氣相色譜，并獲得諾貝爾獎(jiǎng)。60年代末，出現(xiàn)商業(yè)高效液相色譜（HPLC),但是由于泵、檢測(cè)器的發(fā)展滯后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速發(fā)展。經(jīng)典的LC色譜（柱色譜）經(jīng)典LC特點(diǎn)：僅做為一種分離手段（1）柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻（2）常壓輸送流動(dòng)相（3）柱效低（H↑，n↓）（4）分析周期長(zhǎng)（5），僅靠肉眼觀測(cè)，且無(wú)法在線檢測(cè)HPLC的特點(diǎn)HPLC：分離和分析（1）柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）（2）高壓輸送流動(dòng)相（3）柱效高（H↓，n↑）（4）分析時(shí)間大大縮短（5）靠?jī)x器在線檢測(cè)HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤⒏咝б合嗌V儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置第五節(jié)高效液相色譜儀（Aglient1100）1.真空脫氣機(jī)工作原理：使用半透膜管路，允許氣體分子通過(guò)，液體分子無(wú)法通過(guò)作用：(1)可以有效地降低噪音（2）保證保留時(shí)間具有更好的重現(xiàn)性2．泵

類型：恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用自動(dòng)進(jìn)樣器1．進(jìn)樣裝置1）隔膜進(jìn)樣（高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室）

GC系統(tǒng)壓力較小，可以

HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期）2）閥進(jìn)樣：不必停泵，六通閥2.優(yōu)點(diǎn)：1.在標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣范圍內(nèi)（0.1~100μL),具有良好的重現(xiàn)性和精確度2.自動(dòng)進(jìn)樣針尖取樣位置可設(shè)為負(fù)值（－2.5mm）

4.柱溫箱作用：溶劑管路先在柱溫箱中預(yù)熱，然后才進(jìn)入柱子，保證了溫度的穩(wěn)定性。也意味著保留時(shí)間的重現(xiàn)性得以保證。3.色譜柱：直徑4~6mm,柱長(zhǎng)10~30cm

柱效評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

R，n，fs（拖尾因子）柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗4．檢測(cè)器1）紫外檢測(cè)器：適于吸收紫外光的物質(zhì)1.可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD)特點(diǎn)：在某一時(shí)刻僅可得到某一波長(zhǎng)下的吸光度值；將各個(gè)時(shí)刻所得到的吸光度值描點(diǎn)作圖，即可得到所需的色譜圖。（擁有一個(gè)VWD檢測(cè)器）2.二極管陳列檢測(cè)器（DAD）特點(diǎn)：可得到任一時(shí)刻各個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度值，即可以得到樣品在各個(gè)時(shí)刻的吸收光譜圖；同時(shí)DAD還具有峰純度檢測(cè)的功能，用于初步判斷所得色譜峰是否為純凈物的流出物。（擁有兩個(gè)DAD檢測(cè)器）3.色譜圖與光譜圖的區(qū)別：色譜圖是某一波長(zhǎng)下各個(gè)不同時(shí)刻的吸光度值描點(diǎn)作圖；光譜圖是某一時(shí)刻各個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度值描點(diǎn)作圖。

3.熒光檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)靈敏度高其他檢測(cè)器：折光指數(shù)檢測(cè)器（RID）、電導(dǎo)檢測(cè)器（ECD）近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器（ELSD）有望成為高效液相色譜全新的通用靈敏的質(zhì)量檢測(cè)器.。四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）第四章建立高效液相色譜分析方法的一般步驟通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問(wèn)題：①根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長(zhǎng)）和選用固定相（粒徑及孔徑）。③選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動(dòng)相的組成、流速及洗脫方式。