基因工程-第二章基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶工具酶

-----DNA分子的切割和連接技術(shù)。

Smith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE)對(duì)DNA分子有特異地切割作用。（手術(shù)刀剪）

Khorana又發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶（Ligase），能將DNA片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）

DNA、RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）

構(gòu)成了一個(gè)研究DNA、RNA分子的工具酶箱。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、宿主的限制和修飾現(xiàn)象----發(fā)現(xiàn)

1952～1953年在T偶數(shù)噬菌體和λ噬菌體對(duì)大腸桿菌的感染實(shí)驗(yàn)中研究者發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)象。正是對(duì)限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。

寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的，一種叫修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種叫核酸內(nèi)切限制酶。寄主控制的限制與修飾的作用，一是保護(hù)自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。

根據(jù)限制-修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組DNA技術(shù)學(xué)的重要工具酶。純化后的限制性內(nèi)切酶允許分子生物學(xué)家以一種精確的可重復(fù)的方式切割基因克隆所需的DNA分子。這些酶的發(fā)現(xiàn)是基因工程發(fā)展過(guò)程中的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型

根據(jù)其識(shí)別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。

Ⅱ類：基因工程的工具酶。

Ⅲ類：切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)，一般離識(shí)別位點(diǎn)24bp～26bp，對(duì)分子克隆操作亦無(wú)實(shí)用意義。已有超過(guò)1200種。性質(zhì)

I型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能由3個(gè)亞基組成的復(fù)合功能酶；α內(nèi)切酶活性，β甲基化酶活性，γ特異性識(shí)別序列識(shí)別部位不對(duì)稱序列AACN6GTGC切割部位非特異性，距識(shí)別部位大于1000bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質(zhì)

Ⅲ型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能由2個(gè)亞基組成的雙功能酶；M亞基位點(diǎn)識(shí)別與修飾，R亞基內(nèi)切活性識(shí)別部位5-7bp的不對(duì)稱序列切割部位非特異性，距識(shí)別部位一側(cè)24-26bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質(zhì)Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能獨(dú)立的內(nèi)切酶和甲基化酶識(shí)別部位短小的回文序列（多數(shù)4-6bp）切割部位同于或接近于識(shí)別部位限制作用所需的輔助因子Mg2+三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名

H.D.Smith等于1973年提議的命名系統(tǒng)。名稱的第個(gè)1字母取自它來(lái)源細(xì)菌屬名的第1個(gè)字母，大寫；第2，3二個(gè)字母取自它來(lái)源細(xì)菌的種名的頭2個(gè)字母，小寫；如果它的來(lái)源菌還有株系，則有第4個(gè)字母；若酶的編碼基因位于噬菌體或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外的遺傳成分；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號(hào)。前三個(gè)字母用斜體表示。

第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶所有的限制酶，除了以上名稱外，前面還冠以系統(tǒng)名稱內(nèi)切酶系統(tǒng)名稱R；甲基化酶系統(tǒng)名稱M。例如R.HindⅢ，表示內(nèi)切酶

M.HindⅢ，表示甲基化酶但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的R省略不寫。通常情況下，需要對(duì)克隆的DNA進(jìn)行切割。首先，如果以克隆單個(gè)基因?yàn)槟康?，該單個(gè)基因可能僅僅包含2-3kbDNA，則這個(gè)基因不得不從大的(通常情況下超過(guò)80kb)DNA分子中切割出來(lái)。其次，大的DNA分子不得不被切斷成小的足以被載體攜帶的片段。絕大多數(shù)克隆載體能夠承載的DNA片段處于一個(gè)特定的大小范圍中。比如，以M13噬菌體為基礎(chǔ)的載體，所克隆的DNA分子超過(guò)3kb時(shí)運(yùn)載效率非常低。四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征

Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4--8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

。

GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口

：平端切口、粘端切口5’粘端切口GAATTCCTTAAG

EcoRⅠGCTTAAAATTCGCTCGAGGAGCTCCTCGAGGAGCTC

PstⅠ3’粘端切口DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率對(duì)特定的限制性內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)，在已知長(zhǎng)度的DNA分子中,識(shí)別序列的數(shù)量能夠通過(guò)數(shù)學(xué)方法計(jì)算出來(lái)。這一算法假定核苷酸以一種隨機(jī)方式排列而4個(gè)不同核苷酸以相同的比例出現(xiàn)(例如GC含量：50％)。一個(gè)四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256個(gè)核苷酸出現(xiàn)一次。實(shí)際上，這些假設(shè)不可能完全有效。如，λDNA分子，49kb，GC的含量要少于50％。對(duì)一個(gè)六核苷酸識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)應(yīng)該具有12個(gè)酶切位點(diǎn)。實(shí)際上，這些識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生的頻率要小一些，如：BglⅡ有6個(gè)，

BamHI有5個(gè)，

SalI則只有2個(gè)。同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA五、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件1.為內(nèi)切酶提供一個(gè)合適的環(huán)境(buffer)。所有限制性內(nèi)切酶Ⅱ都需要在鎂離子存在下才發(fā)揮作用。離子強(qiáng)度通常由氯化鈉(NaCl)提供。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適pH在7.4左右。不當(dāng)?shù)沫h(huán)境，不僅會(huì)降低限制性內(nèi)切酶的活性，還會(huì)導(dǎo)致酶的專一性的改變，使DNA切割額外的、非標(biāo)準(zhǔn)的識(shí)別序列。2.限制性內(nèi)切酶的用量供應(yīng)商提供純的已知濃度的溶液。1個(gè)酶單位：被定義為在合適的溫度與緩沖液中，在20μL反應(yīng)體系中，1h完全切割1μgDNA所需要的酶量。對(duì)于大量DNA的酶解，反應(yīng)體積可按比例擴(kuò)大，加入過(guò)量的酶（2～5倍）和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。3.反應(yīng)溫度：絕大多數(shù)，37℃時(shí)活性達(dá)到最大；一小部分需要不同的工作溫度，如SamⅠ酶消化時(shí)，25℃才能達(dá)到酶的最大活性。BacⅠ酶消化時(shí)，50℃才能達(dá)到酶的最大活性。

4.酶解過(guò)程：

酶解體系的確定；成分的混勻；酶切反應(yīng)；終止反應(yīng)。

終止反應(yīng)的方法：

如果酶切下來(lái)的DNA片段用于克隆實(shí)驗(yàn)，則反應(yīng)中的酶應(yīng)該消除掉以保證它不會(huì)意外地消化掉那些將在以后步驟中加入的其他DNA分子?！跋麥纭泵福?/p>

70℃保存很短的一段時(shí)間；苯酚抽提;

加入EDTA(鰲和Mg2+)或加入SDS使酶變性。5.限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果鑒定6.內(nèi)切酶對(duì)DNA分子的不完全酶解：

完全酶切消化作用。

不完全酶切消化作用（構(gòu)建基因組物理圖譜、基因組文庫(kù)及片段連接）。減少酶量，增加反應(yīng)體系，縮短反應(yīng)時(shí)間。六、影響限制性內(nèi)切酶的活性的因素酶的純度DNA樣本的純度DNA甲基化的程度酶切反應(yīng)的溫度和時(shí)間DNA的分子構(gòu)型內(nèi)切酶的緩沖液

如果內(nèi)切酶處于非最適的反應(yīng)條件下其識(shí)別序列位點(diǎn)有時(shí)會(huì)發(fā)生改變，這時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)誤切割的能力叫內(nèi)切酶的星活性。高甘油含量?jī)?nèi)切酶用量過(guò)大低離子強(qiáng)度高pH值含有機(jī)溶劑Mn2+、Cu2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在。第二節(jié)DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵。DNA連接酶OHP5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子。DNA連接酶連接作用的分子機(jī)理連接酶與輔助因子ATP（或NAD+）提供的激活A(yù)MP形成一共價(jià)結(jié)合的酶－AMP復(fù)合物（腺苷酰酶）。同時(shí)釋放出焦磷酸（Ppi）[或煙酰胺單核苷酸（NMN）]。激活的AMP從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’－末端磷酸基團(tuán)上形成DNA－腺苷酸復(fù)合物。3’－OH末端對(duì)活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵將缺口封起來(lái)，同時(shí)釋放出AMP。3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPT4DNA連接酶ATP酶-AMP+PPi大腸桿菌連接酶NAD+酶-AMP+NMN酶3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPAPDNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mM(不能大于1mM)DTTVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量1U酶已經(jīng)足夠DNA連接酶的種類T4噬菌體DNA連接酶分子量68Ku。是噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物，需要ATP作為輔助因子。應(yīng)用最廣。大腸桿菌DNA連接酶分子量75Ku。是大腸桿菌基因組中的lig

基因編碼的產(chǎn)物，需要ATP作為輔助因子。不能連接平末端的兩端片段。假陽(yáng)性背景低。影響連接反應(yīng)的因素溫度

酶最佳反應(yīng)溫度37℃，在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。連接反應(yīng)最佳溫度需介于兩者之間。DNA末端的濃度

兩個(gè)DNA末端間的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，其反應(yīng)速率完全由相互匹配的DNA末端濃度決定。線性分子；環(huán)狀分子重組子的構(gòu)型與DNA濃度及DNA分子長(zhǎng)度存在密切關(guān)系。小分子DNA片段易于分子內(nèi)連接；較長(zhǎng)DNA片段濃度降低有利于分子環(huán)化，濃度增加利于分子間連接。平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)

加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mM第三節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）

能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶的分類

依據(jù)聚合酶使用的模板不同，將其分為兩類：依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(pol

Ⅰ)生物活性５’→３’ＤＮＡ聚活酶活性５’→３’外切酶活性３’→５’外切酶活性置換活性用途

５’ＣＣＧ-ＯＨ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’↓Mg2+

↓dNTPs

↓polⅠ↓５’ＣＣＧＡＴAGＣＴ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’５＇ＣＧＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇↓↓Ｍg2＋↓polⅠ↓

５＇ＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇＋５＇pＣ＋５＇pＧ５＇ＣＧＣＡＣＴ３＇３＇ＧＣＧ５＇↓Ｍg2＋↓polⅠ↓↓５＇ＣＧＣ-ＯＨ３＇３＇ＧＣＧ-p５＇＋５＇pＡ＋５＇pＣ＋５＇pＴ

dNTPs

抑制５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓↓DNase

Ⅰ５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓

↓Ｍg2＋,

polⅠ,＊

dNTP↓５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇５’→３’外切酶活性ＤＮＡ聚活酶活性用途

用切口平移方法標(biāo)記ＤＮＡ用于cＤＮＡ克隆中合成第二鏈用于對(duì)ＤＮＡ分子的３’突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow

）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。

Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow片段

補(bǔ)平限制酶切割ＤＮＡ產(chǎn)生的３’凹端用〔３２Ｐ〕dＮＴＰ補(bǔ)平３’凹端，對(duì)ＤＮＡ片段進(jìn)行末端標(biāo)記對(duì)帶３’突出端的ＤＮＡ進(jìn)行末端標(biāo)記在cＤＮＡ克隆中，用于合成cＤＮＡ第二鏈在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈ＤＮＡ應(yīng)用Ｓanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行ＤＮＡ測(cè)序消化限制酶產(chǎn)生的３’突出端應(yīng)用于ＰＣＲ技術(shù)Ｔ４噬菌體ＤＮＡ聚合酶

生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性3'→5'外切核酸酶活性交換（置換）反應(yīng)用途

5‘CCGOH3'

3'GGCTACGA5'↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓dNTPs5'CCGATGCT3'3'GGCTACGA5'

5'CGCATCT3'

3'GCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓5'CGCOH3'3'GCG5'

+

5'pA

+

5'pC

+

5'pT

5'CGTCGCOH3'

3'GCAGCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓[α-32P]dTTP5'CGOH3'3'GCAGCG5'↓↓5'CGT*OH3'

3'GCAGCG5'

補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化ＤＮＡ后產(chǎn)生的３'凹端對(duì)帶有３'突出端的ＤＮＡ分子進(jìn)行末端標(biāo)記標(biāo)記用作探針的ＤＮＡ片段將雙鏈ＤＮＡ的末端轉(zhuǎn)化成平端使結(jié)合于單鏈ＤＮＡ模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的DAN聚合酶，最初從極度嗜熱的水生菌中純化而來(lái)。它具有2種活性，需Mg2+作輔助因子。５’→３’DNA聚合酶活性；５’→３’外切核酸酶活性。主要應(yīng)用于PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄酶

禽源逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性ＲＮＡ酶Ｈ活性用途

類型性質(zhì)

禽源逆轉(zhuǎn)錄酶鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)源

來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)從一株能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)反轉(zhuǎn)酶基因的大腸桿菌中發(fā)離得到的

肽鏈

兩條多肽鏈

單鏈多肽

生物活性

無(wú)３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、強(qiáng)的ＲＮＡ酶Ｈ活性

無(wú)３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、弱的ＲＮＡ酶Ｈ活性

pＨ值

８．３７．６

５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性

5'T

T

T

T

TOH3'3'AAAAAUCUGUCCUA5'↓↓Mg＋＋↓dNTPs↓逆轉(zhuǎn)錄酶

5'T

T

T

T

TAGACAGGAT3'

3'AAAAAUCUGUCCUA5'

ＲＮＡ酶Ｈ活性

RNA----5'UCCGUA3'

DNA----3'AGGCAT5'

↓逆轉(zhuǎn)錄酶↓

5'UC3'

3'AGGCAT5'

+

5'CGUA3'用途

逆轉(zhuǎn)錄酶主要用于將ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄成雙鏈ｃＤＮＡ在此反應(yīng)中可用３種類型的引物：寡脫氧胸苷酸[12-18]聚體,oligodt特定序列的寡核苷酸標(biāo)記帶５'突出端的ＤＮＡ片段可用于雙脫氧鏈終止法測(cè)序

DNA和RNA的修飾酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transf