第2章 基因工程制藥(二)

第二章第十三節(jié)基因工程藥物的制造實(shí)例一、干擾素干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類型。α型干擾素再分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區(qū)別表現(xiàn)為個(gè)別氨基酸的差異。早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的，產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，不能滿足需要。現(xiàn)在可以利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)、發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)干擾素。1.基因工程菌的組建組建過(guò)程：分離干擾素mRNA，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA克隆到載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12，獲得干擾素基因工程菌。所克隆的干擾素cDNA是從抗病毒活性最高的12SmRNA區(qū)域合成的?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒，含有四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因。pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖重組人干擾素產(chǎn)品組建干擾素工程菌的流程誘生的白細(xì)胞提取全RNA

通過(guò)寡dT-纖維素柱獲得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度離心提取12S的mRNA

自mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA雙鏈cDNA用末端DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或dG尾pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火獲得雜交質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒篩選抗四環(huán)素但對(duì)氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆

用已知干擾素的DNA片段作為探針挑選富有干擾素cDNA的克隆

將干擾素cDNA克隆入表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)

2.基因工程干擾素的制備制備基因工程α-干擾素工藝流程如下：?jiǎn)㈤_(kāi)種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提半成品檢定半成品制備精提

分裝凍干成品檢定成品包裝α2b干擾素生產(chǎn)過(guò)程1.發(fā)酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，質(zhì)粒用PL啟動(dòng)子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白凍、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。接種后搖床培養(yǎng)30℃，10h，發(fā)酵種子。15L發(fā)酵罐培養(yǎng)，30℃，轉(zhuǎn)速500r/min，8h。然后42℃下誘導(dǎo)，2～3h。離心去上清。2.產(chǎn)品的提取與純化

4000r/min離心30min，去上清后，濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分用溶解緩沖液進(jìn)行處理，上清超濾濃縮，SephadexG-50分離。經(jīng)SDS檢查。再經(jīng)DE-52柱純化。3.質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求3.1半成品檢定⑴干擾素效價(jià)測(cè)定⑵蛋白質(zhì)含量測(cè)定⑶比活性⑷純度測(cè)定⑸相對(duì)分子量測(cè)定⑹殘余外源性DNA含量測(cè)定⑺殘余血清igG含量測(cè)定⑻殘余抗生素活性測(cè)定⑼紫外光譜掃描⑽肽圖測(cè)定⑾等電點(diǎn)測(cè)定⑿除菌半成品干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)。3.2成品檢定⑴物理性狀⑵鑒別試驗(yàn)⑶水分測(cè)定⑷無(wú)菌試驗(yàn)⑸熱原試驗(yàn)⑹干擾素效價(jià)測(cè)定⑺安全試驗(yàn)二、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）是一個(gè)具有多項(xiàng)潛能的造血生長(zhǎng)因子，它不僅能夠促進(jìn)造血前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟，而且對(duì)其它的細(xì)胞，如抗原遞呈細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、皮膚粘膜細(xì)胞等，均有著不同程度的刺激作用。GMCSF對(duì)某些疾病，如腫瘤患者放療、化療以后的白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血和骨髓移植的治療有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治療中也有良好的療效。1985年Sieff等發(fā)表了第一篇有關(guān)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的文章后，這些年來(lái)有關(guān)rhGMCSF研究報(bào)道的文獻(xiàn)每年均在千篇左右。GMCSF是糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為22000，基因定位在第5條染色體長(zhǎng)臂上，基因約2.5kb，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。其mRNA包括編碼成熟蛋白質(zhì)的127個(gè)氨基酸殘基和信號(hào)肽的17個(gè)氨基酸殘基的密碼子。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)品1.人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的制備利用表達(dá)分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)和生物活性的GMCSF，表達(dá)量高，易于純化，無(wú)需復(fù)性，純化的GMCSF比活高于包含體型，但其發(fā)酵表達(dá)技術(shù)較難掌握。分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF發(fā)酵工藝發(fā)酵甘油保存菌劃平皿，挑取單菌落，接種于LB種子培養(yǎng)基中，18h，再擴(kuò)大培養(yǎng)12h，接種于30L發(fā)酵罐，30℃培養(yǎng)，過(guò)程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培養(yǎng)20h左右時(shí)開(kāi)始表達(dá)，28h表達(dá)是高峰，之后細(xì)菌開(kāi)始死亡，雜蛋白增加。培養(yǎng)過(guò)程中，尤其是對(duì)數(shù)期，用葡萄糖的加量來(lái)控制細(xì)菌生長(zhǎng)速度，以免溶氧量下降過(guò)快。發(fā)酵產(chǎn)物為分泌型GMCSF，占菌體總蛋白的25%以上。發(fā)酵產(chǎn)物收集、純化離心離子交換層析或親和層析純化超濾濃縮，分子篩除菌過(guò)濾、分裝、凍干近年應(yīng)用較多的還有融合蛋白表達(dá)GMCSF的方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′換用ＴＡＡ終止密碼，將其克隆入多種不同表達(dá)融合蛋白的載體中，并在ｃＤＮＡ與上游細(xì)菌蛋白基因之間嵌入凝血酶接頭，導(dǎo)入適當(dāng)宿主后均獲得高效表達(dá)，表達(dá)融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后釋放出Ｎ－末端與天然成熟蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)（糖基化除外）完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，經(jīng)層析純化可得到適宜人體應(yīng)用的活性蛋白。2.質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求半成品檢定

主要包括下列項(xiàng)目：蛋白質(zhì)含量測(cè)定，活性測(cè)定，比活性測(cè)定，相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，純度測(cè)定，核酸含量測(cè)定，鼠IgG含量測(cè)定，等電點(diǎn)測(cè)定，無(wú)菌試驗(yàn)，熱原質(zhì)等。成品檢定

主要包括下列項(xiàng)目：外觀檢查，活性測(cè)定，水分測(cè)定，無(wú)菌試驗(yàn)，安全毒性試驗(yàn)，熱原質(zhì)試驗(yàn)，肽圖測(cè)定等。三、人白細(xì)胞介素-2人白細(xì)胞介素-2（interleukin-2,IL-2）是由T淋巴細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，為一種多肽類藥物，又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。其在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要作用，是一種免疫增強(qiáng)劑，具有抗病毒、抗腫瘤及改善和提高機(jī)體免疫功能的作用。天然白介素-2由396個(gè)核苷酸加上起始密碼和終止密碼組成，編碼133個(gè)氨基酸，其中含有三個(gè)半胱氨酸（58、105和125位），第125位Cys的巰基游離，易引起IL-2分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配或分子間二聚體的形成，從而降低IL-2的生物活性與穩(wěn)定性，同時(shí)增加其不良反應(yīng)。重組的未加改構(gòu)的人白介素-2多以包含體形式表達(dá)，在變性與復(fù)性過(guò)程中易形成二硫鍵錯(cuò)配，為進(jìn)一步提純帶來(lái)困難。為解決上述問(wèn)題，可將重組IL-2經(jīng)過(guò)密碼子突變，將第125位的半胱氨酸改為丙氨酸。1.重組人白細(xì)胞介素-2重組人白細(xì)胞介素-2是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆到人的白細(xì)胞介素-2cDNA，再通過(guò)基因定點(diǎn)突變技術(shù)，針其第125位半胱氨酸的密碼子突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸的密碼子，從而防止分子內(nèi)二硫鍵的錯(cuò)配或分子間二聚體的形成，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性與生物活性，減少不良反應(yīng)。在臨床應(yīng)用上與普通IL-2比較，改構(gòu)體的活性增高，療效增強(qiáng)，半衰期延長(zhǎng)，熱穩(wěn)定性好，純度高，不良反應(yīng)顯著減少。重組時(shí)利用定點(diǎn)突變方法將天然IL-2的第125位氨基酸由Cys改為Ala（密碼子由TGT變?yōu)镚CT），獲得新型IL-2——

設(shè)計(jì)并人工合成兩條寡核苷酸引物：引物1：5’-AGC

AAT

TCCATGGCACCTACTTCAAGT-3’引物2：5’-ATGGATCC

TTATCAAGTCAGAGTCGAGATGATGCTTTGAGCAAAGGT-3’1.重組人白細(xì)胞介素-2工程菌的生產(chǎn)PCR擴(kuò)增得到0.4kb大小的DNA片段，經(jīng)鑒定為含Ala125突變的IL-2基因。PCR片段用EcoRⅠ-BamHⅠ雙酶切。將表達(dá)質(zhì)粒pBV220同樣用EcoRⅠ-BamHⅠ酶切，并用T4DNA連接酶使之與PCR擴(kuò)增的重組IL-2編碼基因連接，得到重組質(zhì)料pBV220/IL-2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到Ala125IL-2的工程菌株。表達(dá)的Ala125IL-2可占菌體總蛋白的42.7%。超聲波裂菌離心收集包含體SephacrylS200凝膠過(guò)濾氧化劑復(fù)性透析除鹽獲得純品產(chǎn)品純HPLC分析鑒定，純度可達(dá)99%以上，用3H-TdR摻入法進(jìn)行活性測(cè)定，比活性1×107U/mg，比野生型IL-2比活性平均提高30%。rhIL-2產(chǎn)品四、重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)早在1940年，Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發(fā)現(xiàn)一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。1974年該物被分離純化，并命名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）。接著，人們又分離出一種與之高度同源的物質(zhì)，由于它含有較多的酸性氨基酸堿基，等電點(diǎn)為酸性（5.6），故命名為酸性FGF（aFGF）。先發(fā)現(xiàn)的FGF因?qū)λ岷蜔崦舾?，等電點(diǎn)呈堿性（9.6），則稱為堿性FGF（bFGF）?，F(xiàn)今資料表明，bFGF的生物學(xué)作用極其廣泛，它在血管形成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)、促進(jìn)組織再生和神經(jīng)組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用。bFGF是含155個(gè)氨基酸的促有絲分裂的陽(yáng)離子多肽，其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量為16～18.5KD。bFGF分子結(jié)構(gòu)中有4個(gè)半胱氨基酸，以此形成分子的三維空間結(jié)構(gòu)。由絲氨酸取代半胱氨酸的重組bFGF的生物學(xué)活性不變，而單鏈多肽則易于在大腸桿菌中表達(dá)。bFGF基因位于人的第5對(duì)染色體上，為單拷貝基因，呈不連續(xù)狀態(tài)，其功能區(qū)被兩個(gè)內(nèi)含子隔開(kāi)分為三個(gè)外顯子區(qū)域。bFGF有很強(qiáng)的肝素親和力。bFGF基因中未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽順序，可經(jīng)自分泌方式釋放。國(guó)內(nèi)第二代基因重組h-bFGF也已經(jīng)問(wèn)世，并正式批準(zhǔn)生產(chǎn)。rh-bFGF工程菌的載體多用PUC系列質(zhì)粒，含有氨芐抗性、LAC啟動(dòng)子，以大菌桿菌作為宿主。生產(chǎn)時(shí)使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，rh-bFGF可分泌至胞漿中，采用連續(xù)流加葡萄糖的高密度分批發(fā)酵工藝，經(jīng)11h后可獲得產(chǎn)量達(dá)200mg/L的bFGF，經(jīng)親和層析（多用肝素親和）純化后可獲得高純度的bFGF，其理化及生物學(xué)特點(diǎn)符合藥用要求。五、重組人超氧化物歧化酶（rh-SOD）SOD是一種生物高效抗氧劑，能特異性消除氧自由基。而rh-SOD不僅僅在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心血管等疾病上有獨(dú)到之處，還廣泛應(yīng)用于保健品、化妝品領(lǐng)域，天然SOD制品是從牦牛血液中提取的，主要以紅細(xì)胞為起始材料，投資大、能耗高、收率低、成本高，價(jià)錢十分昂貴。基因工程的方法：從胎肝中獲取微量rh-SOD后，RT-PCR得到SODcDNA，在大腸桿菌中克隆表達(dá)，并通過(guò)rh-SOD工程菌的發(fā)酵、純化的研制，在模擬生產(chǎn)條件下進(jìn)行中試工藝放大，純化后得到rh-SOD產(chǎn)品。將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養(yǎng)基中，在32℃的溫度下，發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)，再加入占發(fā)酵液重量1％的硫酸銅清液，再向發(fā)酵液加入3倍體積的去離子水，用震動(dòng)式破碎機(jī)劇烈震動(dòng)破碎30min，靜置20min，置入每分鐘