營(yíng)養(yǎng)與代謝的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)

營(yíng)養(yǎng)與代謝的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)劉放南氨基酸分析一、氨基酸在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布食物蛋白質(zhì)肌肉蛋白質(zhì)上皮或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)結(jié)締組織中蛋白質(zhì)血漿蛋白質(zhì)血紅蛋白、白細(xì)胞中蛋白質(zhì)內(nèi)源性蛋白質(zhì)組織或血液蛋白質(zhì)氨基酸合成組織氨基酸生理活性物質(zhì)活性肽生物胺核苷酸和核酸氨基酸吸收血中氨基酸氨基酸分解供能排泄糞氮皮膚、尿尿素、氨二、氨基酸在體內(nèi)的分布比例血液5％肌肉70％組織25％三、氨基酸的分類根據(jù)體內(nèi)合成情況分為：必需氨基酸IleuLeuLysMetPheThrTry

Val非必需氨基酸AlaAryAspCySHGluGlnGlyHisProSerTyrOrn半必需氨基酸ArgOrn根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分為:脂肪族氨基酸：一氨基一羧基酸GlyAlaValLeuIleuSerThrCySHMet一氨基二羧基酸及其衍生物AspAsnGluGln二氨基一羧基酸ArgLys芳香族氨基酸：PheTyr雜環(huán)氨基酸：HisTry四、氨基酸測(cè)定的意義（1）用于監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)支持的病人驗(yàn)證不同氨基酸制劑的效果平衡氨基酸高支鏈氨基酸個(gè)體化氨基酸的監(jiān)測(cè)了解個(gè)體的氨基酸組成是否合理(2)用于診斷疾病

尿3-MH：判斷機(jī)體內(nèi)分解代謝與合成代謝的狀況。如下降反應(yīng)肌肉分解的減少，機(jī)體的合成代謝多于分解代謝，營(yíng)養(yǎng)支持獲得了效果。如上升說(shuō)明分解代謝高于合成代謝，應(yīng)激程度仍重或營(yíng)養(yǎng)支持未能獲得應(yīng)有的效果。BCAA/AAA：正常值—3.0~3.5肝硬化、肝炎等肝臟功能有障礙時(shí)，苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸不能被利用，芳香族氨基酸在體內(nèi)積蓄，支鏈氨基酸因在肝外被氧化供能而量減少。BCAA/AAA下降，過(guò)多的AAA進(jìn)入腦內(nèi)產(chǎn)生假性神經(jīng)遞質(zhì)，影響腦神經(jīng)的功能，出現(xiàn)昏迷，應(yīng)補(bǔ)充高BCAA的氨基酸液。嚴(yán)重感染時(shí)，血清重BCAA/AAA下降的機(jī)理亦為BCAA在肝外被利用，Phe、Tyr因肝功能障礙不能被代謝。診斷對(duì)某一氨基酸代謝有先天性缺陷如苯丙酮尿、高苯丙氨酸血癥、高胱氨酸尿癥、色氨酸血癥、高甘氨酸血癥等，病癥屬少見，但診斷的確定需依賴血清或尿中的氨基酸譜分析。肝豆?fàn)詈俗冃裕恒~的代謝障礙，腎臟也受到損害出現(xiàn)氨基酸尿，Thr、Tyr、Ala、Gln的排出量增加，血清銅值是主要診斷依據(jù)，尿氨基酸分析可以佐證。（3）用于指導(dǎo)治療氨基酸是組成機(jī)體蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)外，它們還具有藥理學(xué)作用。

精氨酸－－解除氨毒，能促進(jìn)分泌胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素、胃泌素與生長(zhǎng)激素的作用，可以促進(jìn)胸腺的生長(zhǎng)，增加免疫能力以及活化吞噬細(xì)胞。

天門冬氨酸－－降低血氨，治療心肺綜合癥、急慢性肝炎并有高氨血癥，治療高膽脂血癥，也是嗎啡的拮抗劑。谷氨酸－－降低血氨，有抗纖維化的作用，可用于治療矽肺與石棉肺。谷氨酰胺－－是小腸特需的氨基酸，不足將引起腸粘膜萎縮，絨毛變細(xì)變短，應(yīng)重視增加此氨基酸。

組氨酸－－可用于治療消化性潰瘍，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與結(jié)核病，它是組成血紅蛋白的必要成份，缺乏時(shí)導(dǎo)致貧血。

苯丙氨酸－－抗憂郁與抗炎的作用

色氨酸－－能控制精神分裂癥、癲癇、抽搐等癥狀。

酪氨酸－－為兒茶酚胺的前體，亦有抗憂郁的作用。（4）用于鑒別組織機(jī)體的每一種組織都由一定的氨基酸組成，在鑒別新生或合成的組織性質(zhì)時(shí)，除細(xì)胞學(xué)鑒定方法外，還可以分析其氨基酸成分，如人工合成的牛胰島素，經(jīng)氨基酸分析后，其含量與自然牛胰島素一樣。骨科手術(shù)治療中，有以自體骨膜修補(bǔ)關(guān)節(jié)面的方法，其后能形成軟骨樣組織，可經(jīng)氨基酸分析，證實(shí)其組成是否與自體的軟骨一樣。氨基酸測(cè)定的方法生化檢驗(yàn)法根據(jù)氨基酸的呈色反應(yīng)

色譜法薄層層析、紙層析液相色譜離子交換法反相分配法高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓：供液壓力和進(jìn)樣壓力很高高速：分離分析的速度快高效：高效固定相、流動(dòng)相選擇性廣高靈敏度：采用了靈敏度較高能連續(xù)測(cè)定樣品組分的檢測(cè)器流出相分容易收集：可以很容易地按照記錄紙上出現(xiàn)地峰用收集器來(lái)收集洗脫出來(lái)地組分流動(dòng)相流動(dòng)相進(jìn)樣器檢測(cè)器工作站高壓泵高壓泵高效液相色譜儀示意圖氨基酸的呈色反應(yīng)氨基酸顯色用試劑和條件呈現(xiàn)色精氨酸-萘酚和次亞氯酸鈉（坂口氏反應(yīng)）紅色胱氨酸、半胱氨酸亞硝基鐵氰化鉀、氰化鈉，在稀氨水中紅色半胱氨酸1，2-萘醌-4-磺酸鈉和次亞硫酸鈉紅色組氨酸、酪氨酸重氮苯磺酸，在堿性溶液中紅色色氨酸乙醛酸，在36N硫酸中紫色對(duì)二甲氨基苯甲醛，在12N鹽酸中藍(lán)色酪氨酸磷鉬鎢酸藍(lán)色Millon反應(yīng)，與硝酸汞在硝酸中加熱紅色酪、色、苯丙氨酸濃硝酸中加熱（黃蛋白反應(yīng)）黃（堿化后轉(zhuǎn)紅）甘氨酸鄰苯二甲醛溶液綠色甲硫氨酸1％高錳酸鉀2％碳酸鈉黃色脯氨酸、羥脯氨酸茚三酮黃色、橙黃靛紅天藍(lán)桂皮醛淺褐紫

各種氨基酸測(cè)定方法的比較分析方法柱后衍生柱前衍生離子交換法茚三酮離子交換法OPA反相分配法OPA反相分配法PITC反相分配法DABS分析時(shí)間80分80分30分15分30分靈敏度通常分析檢測(cè)極限1nmol100pmols1nmol50pmols500pmols10pmols100pmols1pmol300pmols5pmols檢測(cè)1級(jí)、2級(jí)胺可見光：570nm440nm1級(jí)、2級(jí)胺熒光：EX：338nmEM：425nm1級(jí)胺熒光：EX：338nmEM：425nm1級(jí)、2級(jí)胺紫外光：254nm1級(jí)、2級(jí)胺可見光：455nm重現(xiàn)性（BT）0.2%0.2%2%2%0.5%分析精度C.V.%1-2%(1-2nmol)3-5%(1-2nmol)5-10%(50pmol)5-10%(100pmol)2-5%(200pmol)分析裝置HPLC+其他裝置離子交換柱柱后衍生器離子交換柱柱后衍生器ODSC18柱ODSC18柱ODSC18柱

氨基酸正常值（mol/L）磺基丙氨酸121±14異亮氨酸65±14?；撬?30±20亮氨酸131±29門冬氨酸35±5酪氨酸57±14蘇氨酸109±26苯丙氨酸89±20絲氨酸114±20-氨基丁酸75±22谷氨酸96±17組氨酸102±20谷氨酰胺659±100色氨酸92±26脯氨酸142±48鳥氨酸191±34甘氨酸287±49賴氨酸236±39丙氨酸316±16精氨酸95±21胱氨酸53±17纈氨酸187±42蛋氨酸27±7氨基酸測(cè)定時(shí)注意事項(xiàng)好的氨基酸分析要達(dá)到：痕量分析－－在pmol水平簡(jiǎn)化樣品的制備過(guò)程檢測(cè)出所有的氨基酸快速色譜過(guò)程穩(wěn)定的衍生物線性的相應(yīng)氨基酸分析實(shí)驗(yàn)注意A.流動(dòng)相的配制：穩(wěn)定性、純凈、嚴(yán)格的pHB.樣品的預(yù)處理腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)：水解血樣：沉淀法、超濾組織：勻漿、小預(yù)柱C.分析柱的平衡、清洗和儲(chǔ)存收集和儲(chǔ)存樣品血樣－－及時(shí)分離出血清組織－－存放在液氮中3-MH的測(cè)定意義及方法意義：觀察蛋白質(zhì)的分解狀態(tài)原理：PICO-TAG氨基酸分析法，采用異硫氰酸苯酯（PICO）試劑作為柱前衍生劑，衍生反應(yīng)：方法：配制緩沖液：A緩沖液B緩沖液衍生試劑樣品稀釋液尿樣處理：Sep-pakC18小柱處理衍生反應(yīng)：三次冷凍干燥色譜條件及梯度程序：UV:254柱溫：46℃流速1ml/minGln測(cè)定的意義在營(yíng)養(yǎng)液中加用谷氨酰胺可逆轉(zhuǎn)分解導(dǎo)致的不良作用總體上降低骨骼肌氨基酸的流出；防止腸粘膜萎縮，防止菌群易位；增強(qiáng)免疫功能。方法：配制試劑流動(dòng)相A流動(dòng)相B衍生試劑樣品預(yù)處理及衍生：血、肌肉和腸粘膜色譜條件：色譜柱：-BondapakC18250nm4.6nm10m柱溫：20℃UV:340nm梯度洗脫時(shí)間（分）緩沖液A（％）緩沖液B（％）流速（ml/分）0.0083171.23.0062381.23.2060401.212.0060401.214.0083171.218.0083171.2精密度實(shí)驗(yàn)：變異系數(shù)4.21%回收率：96.757.89%最低檢測(cè)限：40nmol/L正常值：男688.906106.15女630.71499.32p<0.05羥脯氨酸測(cè)定意義和方法意義羥脯氨酸（Hpro）為前膠原、膠原蛋白合成必需的前體氨基酸，外科腹腔感染病人肉芽組織中Hpro含量均明顯下降，而導(dǎo)致局部前膠原及膠原蛋白合成抑制，影響了組織愈合能力。有研究表明，臨床感染病人使用了生長(zhǎng)激素（GrowthHormone）后可提高肉芽組織中Hpro的含量，促進(jìn)組織生長(zhǎng)愈合。外科腹腔感染病人使用生長(zhǎng)激素時(shí)，常檢測(cè)肉芽組織內(nèi)Hpro的含量，以調(diào)整生長(zhǎng)激素的用藥量。方法

樣品處理：從液氮罐中取出肉芽組織，稱取100mg左右置碾缽中，倒入液氮，待組織冷凍干燥堅(jiān)硬后進(jìn)行碾磨，粉碎后再加入液氮碾磨，如此反復(fù)3次。加0.2ml樣品稀釋液后超濾，取濾液10l注入0.5cm5cm的玻璃樣品小管中，衍生干燥后進(jìn)樣。試劑：A緩沖液：三水醋酸鈉、水、乙晴、少量的EDTAB緩沖液：乙腈、水、甲醇衍生劑：異硫氰酸苯酯（PITC）色譜條件分析梯度表時(shí)間（min）A%B%初始10006.010007.0010011.0010012.0100032.01000氮平衡測(cè)定的意義氮平衡－－機(jī)體每日攝入氮量與排出氮量的得失總結(jié)可動(dòng)態(tài)地反映蛋白質(zhì)和能量的平衡狀態(tài)測(cè)定方法：1尿尿素氮的測(cè)定：硫胺脲法操作方法試劑標(biāo)準(zhǔn)（ml）測(cè)定（ml）尿素氮標(biāo)準(zhǔn)液0.5尿稀釋液0.5DAM-TSC液0.50.5酸混和液4.04.0注意：尿放防腐劑；煮沸時(shí)間準(zhǔn)確；濃度過(guò)大應(yīng)稀釋計(jì)算：尿中尿素氮g/24h尿＝測(cè)定管/標(biāo)準(zhǔn)管224h尿量（L）氮排泄量＝尿尿素氮＋4g（皮膚0.5g，糞便1-1.5g，氨素，尿中未測(cè)定的蛋白質(zhì)分解終產(chǎn)物2g）2凈氮：微量凱氏定氮法：

操作方法：消化、蒸餾、滴定

例腸移植病人氮平衡用藥后（天）12345灌注氮（g）9.69.69.69.69.624h糞定氮（g）3.82.11.91.62.124h尿定氮（g）10.97.39.19.18.1氮平衡-5.110.2-1.4-1.1-0.6微量蛋白的測(cè)定

前白蛋白、纖維連接蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及C-反應(yīng)蛋白、2-巨球蛋白

測(cè)定方法：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散法－－抗原定量方法

原理：抗原和抗體反應(yīng)后在瓊脂凝膠上形成沉淀環(huán)，根據(jù)抗原的含量和沉淀圈的直徑成比例關(guān)系來(lái)進(jìn)行抗原的定量。操作：以生理鹽水配制0.06MpH8.6的巴比妥緩沖液1、2％瓊脂糖，每管4ml分裝2、0.1ml抗血清＋3.9ml生理鹽水與4ml2％瓊脂糖混合澆板3、樣品稀釋：0.1ml血清＋0.9ml蒸餾水4、加樣：免疫擴(kuò)散板上打孔，取稀釋血清10l點(diǎn)樣5、24h37℃孵育后測(cè)定沉淀圈直徑6、根據(jù)不同稀釋度的參考血清做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)回歸方程lgy=ax+b,換算出沉淀圈在4.0~15.0mm之間對(duì)應(yīng)的蛋白含量，同時(shí)乘以標(biāo)本稀釋系數(shù)。正常值參考范圍：男女轉(zhuǎn)鐵蛋白（mg/L）2524±3992739±520前白蛋白（mg/L）300±60230±30纖維連接蛋白（mg/L）231±46維生素C測(cè)定的意義和方法意義

維生素C（抗壞血酸，Ascorbicacid）人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是機(jī)體主要的抗氧化屏障，能改善機(jī)體的免疫功能，并參與氨基酸的代謝，在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、多器官功能障礙、再灌注損傷等方面具有一定的輔助治療作用。方法樣品處理靜脈血2ml離心0.4ml血漿去蛋白肝素抗凝進(jìn)樣10l濾液色譜條件色譜柱：YWG-NH24.6mm200mm10um檢測(cè)器：UV256nm流動(dòng)相：9.0/91.0(甲醇/水)＋pH3.05mmol/LH3PO4緩沖溶液流速1.0ml/min注意事項(xiàng)血漿中維生素C極易氧化降解，因而采集標(biāo)本后應(yīng)立即檢測(cè)，如需保存樣品應(yīng)加入等量維生素C保護(hù)液（0.35mol/L高氯酸＋0.27mmol/L乙二胺四乙酸鈉＋0.1%二硫蘇糖醇）血內(nèi)維生素E的檢測(cè)維生素E的功能1、通過(guò)阻礙膽固醇升高來(lái)防止動(dòng)脈阻塞，是一種強(qiáng)大的反凝結(jié)物質(zhì)。2、減緩所有細(xì)胞和組織的衰老。3、保護(hù)身體免受環(huán)境污染物的損害。4、保護(hù)紅血球健康，并防止貧血。5、改善大多數(shù)皮膚病。6、幫助傷口更快地愈合。樣品制備：200μL血清＋400μL（乙腈：無(wú)水乙醇50：50混和液），渦旋混合，取上清夜，再加入400μL正己烷混和移取正己烷層，氮?dú)獯蹈?。進(jìn)樣時(shí)加入流動(dòng)相200μL溶解。色譜條件：色譜柱：XTerraRP18(3.9mm×150mm×5μm)柱溫：30℃流動(dòng)相：甲醇：水（92：8v/v）流速：1ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：292nm進(jìn)樣量：20μL維生素E標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖血清樣品色譜圖維生素EB族維生素檢測(cè)B1、B6、B1224例正常人血液標(biāo)本20例克隆氏病人血液標(biāo)本均有明顯差異臨床：克隆氏病人用藥后是否能提高，等待樣品乳果糖/甘露醇排出率的測(cè)定

意義和方法意義：這兩種糖不被機(jī)體代謝，口服后以原形從尿中排泄，尿中的排出量可反映腸道的吸收量。目前認(rèn)為它們通過(guò)腸粘膜的途徑主要取決于其分子的體積。甘露醇是單糖（分子量182），分子較小，主要通過(guò)腸粘膜細(xì)胞膜上的水溶性微孔透過(guò)腸粘膜。乳果糖是雙糖（分子量342）分子較大，主要通過(guò)腸粘膜細(xì)胞間的緊密連接透過(guò)腸粘膜，這也是細(xì)菌及其毒素通過(guò)腸粘膜的途徑。在疾病狀態(tài)下，腸粘膜可能萎縮，吸收面積減少，甘露醇通過(guò)減少。同時(shí)，因腸粘膜細(xì)胞間的緊密連接受到破壞，乳果糖通過(guò)增加。這樣可使乳果糖/甘露醇排出率比值增加，這是臨床評(píng)估腸粘膜完整性和診斷腸粘膜屏障功能的方法。方法

儀器Waters高效液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)：示差折光檢測(cè)儀，加熱溫度37℃，靈敏度32流動(dòng)相：乙腈/水72：28色譜柱：AltimaAmino5um250mm4.6mm柱溫：32℃尿處理:尿樣離心10min，取上清0.4ml超濾去蛋白取濾液＋100mg陰陽(yáng)離子交換樹脂，充分振蕩，離心取上清，過(guò)0.5um膜。GC測(cè)定游離脂肪酸儀器：HP-4890D氣相色譜儀FID檢測(cè)器HP-3398色譜工作站色譜條件：

色譜柱：HP30m0.32mm0.25μm石英毛細(xì)管柱，柱箱梯度升溫155℃～200℃，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣器溫度230℃，載氣（N2）流速為20ml/min。血標(biāo)本預(yù)處理0.5ml血清＋10ml內(nèi)標(biāo)溶液＋2ml三氯甲烷/異丙醇（9：1％）＋2MHCl30μl，振蕩、離心，取下層1ml吹干＋BF3-2/甲醇（1：3）0.5ml,70℃反應(yīng)10min，冷卻，＋0.5ml水1.5ml正己烷，振蕩、離心，取上層液1ml，吹干。進(jìn)樣時(shí)以正己烷溶解，進(jìn)樣1-2μl。游離脂肪酸C6:0C8:0C10:0C12:0C14:0C16:0C18:0C20:0C22:0C24:0短鏈脂肪酸短鏈脂肪酸是指含碳2－4個(gè)的直鏈或支鏈脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。短鏈脂肪酸是腸道上皮的特殊營(yíng)養(yǎng)因子：維護(hù)全腸道上皮細(xì)胞的完整性和杯狀細(xì)胞的分泌功能。對(duì)粘膜免疫細(xì)胞有維護(hù)作用。于結(jié)腸中產(chǎn)生并分解結(jié)腸中的益生菌。樣品制備：超濾，截留10000分子量的物質(zhì)（去除蛋白）色譜條件：色譜柱μBondparkC184.6×250mm柱溫35℃流動(dòng)相A液pH2.35的磷酸緩沖液B液甲醇D-木糖的測(cè)定

測(cè)定的意義D-木糖吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)芰己玫胤磻?yīng)小腸吸收功能，