生化實(shí)驗(yàn)01-蛋白質(zhì)含量的測定

實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度實(shí)驗(yàn)室安全（人身安全、財(cái)產(chǎn)安全、環(huán)境安全）規(guī)范操作（2人/組，每人必須動(dòng)手做實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生（儀器、試劑、器皿、桌面，值日生）實(shí)驗(yàn)報(bào)告（完整、規(guī)范，原始數(shù)據(jù)，結(jié)果分析討論）不能遲到早退，不能在實(shí)驗(yàn)室吃東西12實(shí)驗(yàn)01植物組織中蛋白質(zhì)含量的測定

（Folin—酚試劑法）了解、掌握可溶性蛋白質(zhì)測定的常用方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理Folin-酚試劑法（Lowry法）結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)。第一步反應(yīng)：在堿性條件下，蛋白質(zhì)的肽鍵與銅結(jié)合生成紫紅色的蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物(雙縮脲反應(yīng))；第二步反應(yīng)：此絡(luò)合物及蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸等使磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物質(zhì)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正相關(guān)，在650nm下比色測定即可進(jìn)行定量測定。41.Folin—酚試劑法的特點(diǎn)

（1）靈敏度高：比雙縮脲法高100倍。

（2）適用范圍：微量蛋白質(zhì)（0.02～0.50mg/mL）測定.2.干擾因素：

酚類、檸檬酸和巰基類化合物等還原性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。5三、材料、設(shè)備與試劑（一）實(shí)驗(yàn)材料

綠豆芽下胚軸（二）設(shè)備

天平；分光光度計(jì)；移液器等。（三）試劑

1.Folin試劑甲--試劑A：試劑B=50：1(V/V)現(xiàn)配現(xiàn)用2.Folin試劑乙（已配制）

3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：250μg/mL。6四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)12345樣品溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(mL)00.20.40.60.81.0mL蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20試劑甲5mL，混勻后室溫下放置5~10min試劑乙0.5mL（逐一加入并立即混勻），20~30min后，測定A6507標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

以每管標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A650）為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。比色測定：

1號(hào)管為空白，在650nm波長下用10mm光程的比色皿測定各管的吸光度。A650蛋白質(zhì)(μg)080.2～0.5g綠豆芽下胚軸于研缽中—→加1~2mL水—→研磨、勻漿后定容至25mL—→室溫下放置10~20min（間歇振蕩）—→過濾后得到待測樣品溶液。分別取樣品待測液1.0mL于3支試管中（3次重復(fù)）進(jìn)行顯色、測定（參考制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟）。（二）樣品中蛋白質(zhì)的提取及測定重現(xiàn)（復(fù)）性、嚴(yán)謹(jǐn)性、透明性和獨(dú)立驗(yàn)證是科學(xué)方法的基石生物重復(fù)（

biologicalrepeats）實(shí)驗(yàn)重復(fù)或技術(shù)重復(fù)（technicalrepeats）9對照組處理組R1R2R3T1T2T3R1-1R1-2R1-3R2-1R2-2R2-3R3-1R3-2R3-3T1-1T1-2T1-3T2-1T2-2T2-3T3-1T3-2T3-33個(gè)生物重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)10五、原始數(shù)據(jù)

A650的記錄管號(hào)12345測定-1測定-2測定-3標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量(μg)050100150200A650W=VT=VS=N=六、結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：1、坐標(biāo)紙繪制2、在excel中繪制并求

出回歸方程11蛋白質(zhì)含量（

μg

）A650501001502000.30.20.112X：根據(jù)樣品的吸光值查得的蛋白質(zhì)含量（μg）；X1=,X2=，X3=，X平均=13樣品中蛋白質(zhì)的含量（mg/g）＝X：根據(jù)樣品的吸光值查得的蛋白質(zhì)量（μg）；VT：提取液總體積（mL）；Vs：測定時(shí)取用的樣品