生化20重組DNA技術(shù)

第二十章重組DNA技術(shù)recombinantDNAtechnique第一節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本過程重組DNA技術(shù)：又稱DNA克隆或基因克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將不同來源的特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子?？寺?clone)：來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』?cloning)：獲取這類同一的DNA分子群體、細(xì)胞群體或個體群體的過程，即無性繁殖。重組DNA(recombinantDNA,或嵌合DNA,chimeraDNA)：采用克隆技術(shù)，把來自不同生物的外源DNA插入載體分子所形成的雜合DNA分子。重組DNA技術(shù)的基本過程

第二節(jié)重組DNA技術(shù)中常用工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶三、DNA聚合酶四、其它修飾酶

1.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)—基因工程的手術(shù)刀功能：

識別雙鏈DNA中特異序列，該序列的特征為4-6個核苷酸的回文結(jié)構(gòu)，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割DNA，產(chǎn)生黏性末端或平末端。

根據(jù)需要在特定的位點精確切割雙鏈DNA分子。作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)

(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG

作用模式圖：（1）產(chǎn)生5

突出黏性末端

(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—

作用模式圖：（2）產(chǎn)生3突出黏性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********

作用模式圖：（3）產(chǎn)生平末端

(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************同裂酶來源不同但能識別相同序列的酶，又稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的黏性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

可變酶

識別DNA序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過6個核苷酸。此類酶是Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC;

Bbl

ⅠGCC(N)4NGGC2.

DNA連接酶(DNAligase)

—基因工程的縫紉針

將兩條雙鏈DNA片段連接起來，實現(xiàn)DNA的體外重組。功能：

催化兩條雙鏈DNA分子的互補黏性末端或平末端的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸酯鍵。

也可將雙鏈DNA分子內(nèi)部的單個切口(無核苷酸空缺)連接起來。還可作用于RNA，但效率很低。

DNA連接酶催化平末端連接要比黏性末端效率低得多。

DNA連接酶有T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶

DNA連接酶

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—DNA連接酶作用模式圖：（1）連接黏性末端

作用模式圖：（2）連接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************DNA連接酶

能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNA分子引物鏈的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用

類型：

大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段

TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶

三、DNA聚合酶

四、其它修飾酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）

功能：催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3′突出末端的雙鏈DNA。OH5′3′Mg2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A、G、C、T)n末端轉(zhuǎn)移酶

(2)底物是平端或3′凹端的雙鏈DNA。5′3′Co2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′Co2+dNTPnppi5′3′OHOH(A、G、C、T)n

用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3′

末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）DNA3′末端的同位素標(biāo)記。

目的基因進(jìn)入原核或真核細(xì)胞并高效復(fù)制和表達(dá)蛋白質(zhì)，需要裝入載體才能實現(xiàn)。載體（vector）

指能攜帶外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運載工具第三節(jié)重組DNA技術(shù)中常用載體

作為基因工程載體所需具備的基本條件能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(外源DNA插入點)，常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA；拷貝數(shù)高具有較高的遺傳穩(wěn)定性克隆載體(cloningvector)

為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體。表達(dá)載體(expressionvector)

為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體。

質(zhì)粒載體：最常用的對目的基因克隆

噬菌體：主要用于構(gòu)建基因組DNA或

cDNA文庫M13噬菌體：專用于Sanger雙脫氧DNA測序

粘粒：用于克隆大片段DNA

酵母質(zhì)粒：用于在酵母中表達(dá)目的蛋白病毒：包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物毒，用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白

基因工程載體的種類和用途1.質(zhì)粒(plasmid)載體

細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒

細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。

AmprORITetrpBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：復(fù)制起始點，保證高拷貝自我復(fù)制。結(jié)構(gòu)與功能：Ampr,

Tetr：兩個抗性基因用于篩選陽性克隆。PstI,BamHI：兩個單酶切位點用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSMCS：MultipleClonningSite提供多個單酶切位點用于克隆操作LacZ:藍(lán)白斑篩選陽性克隆第四節(jié)目的基因的獲得和體外重組

一、目的基因的獲得

----分二、目的基因的體外重組

----切、接目的基因

(targetDNA)cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)目的:

分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列

獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）種類：（一）化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列（二）聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)（三）從基因文庫中篩選（一）目的基因的獲取—分*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶

載體

受體菌

復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因

反轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT

基因組文庫：G-文庫cDNA文庫：c-文庫

(常用)方法：基因文庫

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆。（三）外源基因與載體的連接—接1.黏性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接

(2)不同限制酶切位點連接

配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平末端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生黏性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄4.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再進(jìn)行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT

5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA