結(jié)核病實驗室診斷201609

結(jié)核病實驗室診斷檢驗科任易1.結(jié)核病背景資料2.結(jié)核病常規(guī)檢驗3.

結(jié)核病實驗室診斷4.體外r-干擾素釋放試驗5.小結(jié)背景—結(jié)核病流行現(xiàn)狀全球有三分之一人口（20億）感染了結(jié)核桿菌我國現(xiàn)患肺結(jié)核病人達500萬，占全球病人總數(shù)的1/4背景—結(jié)核病感染、傳播、發(fā)病過程潛伏感染

染肺病或其他疾病潛伏感染復(fù)發(fā)

細菌在人體復(fù)制播散

Disseminates發(fā)作

Onset康復(fù)

Recovery時間表Time診斷

Diagnosis治療

Treatment痊愈≥2個月（months）背景—當前結(jié)核病的研究新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%)JID2012:205(Suppl2),S147.背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）簡稱為結(jié)核桿菌（tuberclebacilli）。早在1882年，德國細菌學(xué)家柯赫（RobertKoch）就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。在微生物分類中，結(jié)核分枝桿菌屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬分枝桿菌復(fù)合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌背景—結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)（1）結(jié)核桿菌可經(jīng)多途徑感染，由呼吸道、消化道和破損皮膚侵入機體，最常見為經(jīng)呼吸道感染引起肺結(jié)核。（2）結(jié)核桿菌無內(nèi)毒素和外毒素，也不產(chǎn)生侵襲性酶，其致病性主要與其細胞壁內(nèi)含大量脂質(zhì)有關(guān)。主要包括：①磷脂：可刺激單核細胞增生，與結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死形成有關(guān)②分枝菌酸：與抗酸染色性有關(guān)③索狀因子：可破壞細胞線粒體膜，與慢性肉芽腫形成有關(guān)④硫酸腦苷酯：抑制吞噬溶酶體形成，具有抗吞噬作用⑤蠟質(zhì)D，可刺激機體的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。（3）結(jié)核桿菌主要引起細胞免疫反應(yīng)，屬于傳染性免疫結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗三大常規(guī)（血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)）血沉血流變檢測肺結(jié)核患者血液粘滯性、凝固性、聚集性均增高，血流緩慢，易于促成肺內(nèi)微血栓形成

——《微循環(huán)學(xué)雜志》

常規(guī)檢測，無特異性。結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗腺苷脫氨酶（ADA）:其血清/漿膜腔積液比值更有意義。C反應(yīng)蛋白（CRP）:X線提示有空洞的結(jié)核病人比沒有空洞的結(jié)核病人以及健康人顯著升高。但是CRP正常不能排除結(jié)核病。

——Infection.17(1):13-4,1989Jan-Feb輔助治療檢測：肝功能、腎功能、血脂、血糖。。。。NSE、AFU等指標用于鑒別診斷。CA125標志的使用，可以作為結(jié)核病療效判斷指標。結(jié)核病與肺部腫瘤患者均升高?！吨袊鴮嵱脙?nèi)科雜志》2003年第2期結(jié)核病患者的常規(guī)檢驗超敏C反應(yīng)蛋白：肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致機體細胞免疫功能下降的慢性呼吸道傳染病，患者血清中HS—CRP、免疫球蛋白、補體可發(fā)生改變。

——《中國實驗診斷學(xué)》2009年01期降鈣素原（PCT）肺結(jié)核患者血清PCT水平明顯低于社區(qū)獲得性肺炎（CAP）患者，HIV陰性的肺結(jié)核患者血清PCT水平并不會明顯增高，故可用于PTB和CAP的鑒別診斷，但當PCT水平大于正常值時，其預(yù)后價值較差。可作為肺結(jié)核和肺結(jié)核伴感染診斷的輔助指標。

——[Eur

Respir

J

2011;

37(2):371]結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)簡介1.結(jié)核抗體2.結(jié)核蛋白芯片3.體外r-干擾素試驗4.結(jié)核桿菌分泌抗原1.涂片2.培養(yǎng)3.藥敏4.菌型鑒定細菌學(xué)免疫學(xué)分子生物學(xué)其他1.HPLC2.質(zhì)譜技術(shù)3.流式技術(shù)1.實時熒光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐藥基因突變5.菌型鑒定6.測序結(jié)核分枝桿菌形態(tài)學(xué)檢測1.直接抹片法2.離心制片法1.抗酸染色2.熒光染色1.普通顯微鏡2.熒光顯微鏡3.自動閱片技術(shù)涂片染色鏡檢結(jié)核桿菌離心制片技術(shù)直接涂片法離心制片法合計陽性陰性陽性41041(15.9%)陰性17199216(84.1%)合計58（22.6%）199(77.4%)2572015年7月至2015年11月，對本院257例痰液和纖維支氣管鏡灌洗液進行直接涂片法和離心制片法比對驗證試驗，結(jié)果如下：結(jié)論：離心制片法的確能提高結(jié)核桿菌涂片檢測的陽性率。結(jié)核桿菌自動閱片技術(shù)2016年2月至2016年3月，本院對308例涂片進行人工閱片和計算機自動閱片比對試驗；結(jié)果符合的為286例，總符合率為92.58%。結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗結(jié)核桿菌體外藥敏試驗MIC測定法固體培養(yǎng)法液體儀器法液體微量法結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗

DrugfreeIsoniazid

Ethambutol

Inoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3++++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗1234

挑取菌落磨菌、稀釋接種菌液孵育7-10天顯色，讀取結(jié)果結(jié)核分枝桿菌液體微量藥敏結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗

收集我院2015年8月至11月的臨床分離菌株511例，使用液體微量顯色法進行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺對氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的體外藥敏試驗

。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。藥物RFPINHSMEMBCPMOFXETHPASLVFMOFRFBAMIKANCLO耐藥例數(shù)80146945850614149536260111387耐藥率%15.728.618.411.49.811.98.09.610.42.517.0結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗結(jié)核分枝桿菌液體微量顯色法藥敏試驗比對實驗

收集臨床分離菌株和國家參比室的質(zhì)控菌株117例，使用液體微量顯色法和羅氏比例法進行了利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫異煙胺、對氨基水楊酸、左氧氟沙星、莫西沙星、

利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四種抗結(jié)核藥物的比對實驗?？偡下食^90%。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷一、結(jié)核分枝桿菌探針溶解曲線技術(shù)結(jié)核病分子生物學(xué)診斷結(jié)果判斷結(jié)核病分子生物學(xué)診斷溶解曲線法比例法藥敏敏感度特異度陽性預(yù)測值%陰性預(yù)測值%總符合率%敏感耐藥%%INH敏感110490.598.295.596.696.1耐藥238RFP敏感103295.897.2耐藥346收集我院樣本庫的臨床分離菌株154例，進行了溶解曲線法耐藥基因突變分析以及羅氏比例法藥敏試驗，總符合率在96%以上。并對耐藥結(jié)果不相符的11株菌進行了基因測序分析，均證實有耐藥基因突變。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷二、結(jié)核分枝桿菌RNA檢測(TB-RNA)RNA作為臨床分子診斷靶標的優(yōu)點：RNA拷貝數(shù)≥DNA拷貝數(shù)更具臨床意義:生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠不如DNA穩(wěn)定，病原體死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.較好的愈后指標結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

統(tǒng)計今年我院住院患者179例，分析涂片、培養(yǎng)和TB-RNA檢測報告，結(jié)果如下：患者類型例數(shù)TB-RNA陽性例數(shù)陽性率涂片陽性272385.2%涂片陰性1424128.9%培養(yǎng)陽性686291.1%培養(yǎng)陰性11121.8%我院涂片、培養(yǎng)陽性率分別為：15.1%和37.9%；TB-RNA的總陽性率為35.8%。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷三、EasyNATTB-DNA檢測（恒溫擴增法）原理：將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術(shù)有機地融為一體，在恒溫擴增反應(yīng)中加入兩對TB特異性引物、一對特異性探針，同時一次性完成TBDNA的擴增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置進行定性診斷。檢測目標片段:目標為結(jié)核分枝桿菌

特異性IS6110片段。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷操作步驟結(jié)核病分子生物學(xué)診斷

2015年6月，我科參加CTCTC“EasyNAT?結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒現(xiàn)場應(yīng)用評估”項目,結(jié)果如下：

患者類型例數(shù)EasyNATTB-DNA檢測陽性率%陽性陰性涂片陽性770100.0涂片陰性432414.7培養(yǎng)陽性1091*90.0培養(yǎng)陰性400400.0注*：1例培養(yǎng)陽性最終鑒定為非結(jié)核分枝桿菌結(jié)核病分子生物學(xué)診斷四、Gen-XpertMTB/RIF進行標本處理、實時PCR和利福平耐藥性檢測的完整平臺痰標本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進行混合處理GeneXpert設(shè)備可進行標本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB實時擴增、應(yīng)用分子燈塔檢測耐藥相關(guān)的突變?nèi)菀资褂?，不需要進行分子生物學(xué)培訓(xùn)操作完全自動化，使用起來既容易又安全。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與PCRTB-DNA檢測的比較：陽性符合率＝99.03％，陰性符合率＝92.61％，總符合率＝95.31％Gen-XpertPCRTB-DNA合計陽性陰性陽性20421225陰性2263265合計206284490結(jié)核病分子生物學(xué)診斷涂片陽性肺結(jié)核:Xpert

檢出率=99.35％涂片陰性肺結(jié)核:Xpert檢出率=35.32％Gen-Xpert涂片結(jié)果合計陽性陰性陽性15271223陰性1130131合計153201354結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與BD960液體培養(yǎng)比較實驗：陽性符合率＝95.52％，陰性符合率＝95.51％，總符合率=95.51％Gen-Xpert培養(yǎng)+鑒定結(jié)果合計陽性陰性陽性21312225陰性10255265合計223267490結(jié)核病分子生物學(xué)診斷XpertMTB/RIF與比例法藥敏比較實驗：陽性符合率

＝96.88％，陰性符合率

＝95.53％，總符合率

＝95.73％，Gen-Xpert利福平藥敏試驗合計耐藥（陽性）敏感（陰性）耐藥（陽性）31839不確定022敏感（陰性）1171172合計32179211結(jié)核病分子生物學(xué)診斷WHO關(guān)于XpertMTB/RIF的建議XpertMTB/RIF應(yīng)該用于MDR-TB的高危人群、以便盡早發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者，有效控制疫情。XpertMTB/RIF在MDR或HIV問題不十分嚴重的地區(qū)，可以考慮作為顯微鏡檢查基礎(chǔ)之上的后續(xù)檢測，特別是用于涂陰標本的進一步檢測。體外r-干擾素釋放試驗蛋白質(zhì)水平結(jié)核菌素試驗（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)潛伏性結(jié)核（LTBI）體外r-干擾素釋放試驗γ

干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞γ干擾素體外r-干擾素釋放試驗

特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)

靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)體外r-干擾素釋放試驗陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）實驗效果圖體外r-干擾素釋放試驗檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結(jié)果體外r-干擾素釋放試驗

陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾??；③實驗非正常操作。

陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結(jié)果：4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）體外r-干擾素釋放試驗WHO2014《潛伏結(jié)核感染管理指南》建議：1、在HIV感染人群、與肺結(jié)核患者密切接觸的成人和兒童、開始接受抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的患者、接受透析治療的患者、準備接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中開展LTBI系統(tǒng)檢測和治療。檢測LTBI建議使用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）或結(jié)核菌素皮試（TST）。2、對于羈押人員、醫(yī)務(wù)人員、來自結(jié)核病高負擔國家的移民、無家可歸者、以及吸毒人員，可以有條件地開展LTBI系統(tǒng)檢測和治療。3、對于糖尿病人、酒精依賴者、吸煙成癮者、低體重者，如果他們不屬于以上1和2的情況，并不建議常規(guī)開展LTBI的系統(tǒng)檢測。體外r-干擾素釋放試驗LTBI篩查和診斷的建議流程

體外r-干擾素釋放試驗關(guān)于IGRA用于診斷LTBI的研究文獻比較多，在這方面的結(jié)論也比較成熟。Richeldi的綜述認為T-SPOT.TB診斷LTBI的敏感度高于TST，而QFT-GIT診斷LTBI的敏感度與TST相似；無論人群是否接種后卡介苗，T-SPOT.TB和QFT-GIT在診斷LTBI的特異度方面均優(yōu)于TST。

----Richeldi.L.Anupdataonthediagnosisoftuberculsosisinfection.AmJRespir

CritCareMed,2006,174:736-742.

Menzies等在2007年發(fā)表的一篇納入8項研究的meta分析論文中指出，IGRA對于普通人群，尤其是曾經(jīng)接種過卡介苗的人群診斷LTBI具有較高的特異度；但和TST一樣，IGRA的敏感度差強人意，兩者均不能區(qū)別LTBI和活動性結(jié)核病

----MenziesD,PaiM,ComstockG.Meta-analysis:newtestsforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection:areasofuncertaintyandrecommendationsforresearch.AnnInternMed,2007,146:340-354.

IGRA診斷LTBI的價值體外r-干擾素釋放試驗IGRA診斷活動性結(jié)核病的價值

在南非進行的1項募集到491例痰涂陰疑為肺結(jié)核患兒的研究中，結(jié)合臨床資料、胸片以及TST結(jié)果診斷肺結(jié)核的曲線下面積為85%（95%CI80%–90%）。該研究最重要的價值在于發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB相對于臨床資料、胸片以及TST的綜合判斷價值而言，并沒有增加額外的診斷價值。

LingDI,NicolMP,PaiM,etal.IncrementalvalueofT-SPOT.TBfordiagnosisofactivepulmonarytuberculosisinchildreninahigh-burdensetting:amultivariableanalysis.Thorax,2013,68:860-866.體外r-干擾素釋放試驗無論是HIV感染者還是非HIV感染者，IGRA的診斷效率與TST相比較均無優(yōu)勢。這些資料清楚地表明，在中低收入國家，IGRA和TST一樣對于診斷成人活動性結(jié)核病沒有任何價值[1]。另有研究指出，IGRA較低的陽性預(yù)測值限制其在中低收入國家成為臨床常規(guī)檢測活動性結(jié)核的手段[2]。實際上，世界衛(wèi)生組織專家組基于現(xiàn)有的證據(jù)明確指出，在中低收入國家不能以IGAR代替常規(guī)的微生物診斷方法用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷[3]。1.

MetcalfeJZ,EverettCK,SteingartKR,etal.Interferon-gammareleaseassaysforactivepulmonarytuberculosisdiagnosisinadultsinlow-andmiddle-incomecountries:systematicreviewandmeta-analysis.JInfectDis,2011,204:S1120-1129.

2.

KangYA,LeeHW,HwangSSetal.Usefulnessofwhole-bloodinterferon-gammaassayandinterferon-gammaenzyme-linkedimmunospotassayinthediagnosisofactivepulmonarytuberculosis.Chest,2007,132:959-965.

3.

WHO.StrategicandTechnicalAdvisoryGroupforTuberculosis(STAG-TB):rep