《基因復(fù)習(xí)題》word版

第八章外源DNA片段與載體DNA的重組主要有哪幾種方法？各自的優(yōu)缺點(diǎn)？（1）黏性末端連接法：.1同一限制酶切位點(diǎn)連接：?jiǎn)蚊盖袃?yōu)點(diǎn)：黏性末端連接可抑制載體和目的DNA分子的自連，因而可大大提高連接的效率。更重要是不同限制性酶切位點(diǎn)的黏性末端連接可以控制目的DNA和載體DNA的連接方向。缺點(diǎn)：載體易自身環(huán)化；不易定向克隆；產(chǎn)生串聯(lián)重組體；難以插入特定的基因；大片段DAN的重組率低，2.不同一限制酶切位點(diǎn)連接：雙酶切優(yōu)點(diǎn)：①不必將原有的內(nèi)切酶失活，可以直接進(jìn)行重組連接；②有原有限制性內(nèi)切酶的重組，載體自連就不會(huì)發(fā)生，不必用堿性磷酸酶進(jìn)行處理，從而得到高效連接。缺點(diǎn)：同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的酶識(shí)別（2）平頭末端連接法：常用①同聚物加尾連接②人工接頭連接等缺點(diǎn)：1效率很低2平頭末端連接常常破壞原有的識(shí)別性序列3雙向插入，由于平頭末端沒有粘性末端的堿基互補(bǔ)限制，只要是平頭末端均能連接，造成插入方向良種可性。4造成多拷貝外源DNA片段插入載體可能性。優(yōu)點(diǎn)::1連上后就能用。2能把任何片段連接起來(lái)第九章1轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。2重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA原理：一抗（primaryantibody）:與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）步驟：①抗體制備（普通抗體、酶標(biāo)記抗體[一抗、二抗]）②抗體或抗原的包被(固定在固相載體上）③免疫反應(yīng)④特異性表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)具體步驟：1）固定樣品：將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。2）一抗結(jié)合：加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。3）二抗結(jié)合：加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。4）顯色反應(yīng)：加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。5）比色：在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮第十章外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。包涵體蛋白：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無(wú)膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。涵體存在部位：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)融合蛋白：將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白稱為融合蛋白。①穩(wěn)定性好；②表達(dá)效率高；③較易于分離純化寡聚型外源蛋白：為提高外源蛋白表達(dá)量，在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋白稱為寡聚型外源蛋白.整合型外源蛋白:為防止外源基因隨質(zhì)粒丟失，將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為整合型外源蛋白。分泌型外源蛋白:外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)運(yùn)輸或分泌的方式穿過(guò)細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中，即為分泌型外源蛋白.1基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別和特點(diǎn)：1）原核生物表達(dá)系統(tǒng)1基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。2當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時(shí)，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA;3與此同時(shí)，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時(shí)轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。2）真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)1轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。2mRNA只能在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過(guò)加工、糖化，形成高級(jí)結(jié)構(gòu)2原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn)：1原核生物多為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。2基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。3多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。4生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。5不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)象。6內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。]3真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的特點(diǎn)：真核生物可識(shí)別并切除外源基因的內(nèi)含子，從而表達(dá)目的多肽，所以不必向原核細(xì)胞表達(dá)體系那樣從mRNA制備cDNA。2真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)是，其SD序列與細(xì)胞核糖體RNA16S亞基3‘末端的互補(bǔ)程度較高，對(duì)于翻譯水平的調(diào)節(jié)有利3在真核細(xì)胞內(nèi)由外源基因表達(dá)的蛋白可被糖基化，成為糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性4外源基因?qū)胝婧思?xì)胞表達(dá)效率較低，其在染色體DNA上的整合是隨機(jī)的和自發(fā)的，還無(wú)法控制整合的位置和適當(dāng)?shù)目截悢?shù)5真核細(xì)胞的培養(yǎng)要求較高，大量生產(chǎn)比較困難，成本較高。2酵母基因表達(dá)載體1）自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，YRP）該載體含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和基因克隆位點(diǎn)等元件，能夠在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。優(yōu)點(diǎn)：在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效率較高，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)可達(dá)200個(gè)。缺點(diǎn)：經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)后，子細(xì)胞中的拷貝數(shù)會(huì)迅速減少。（2著絲粒型質(zhì)粒載體該型質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒載體能平均分配到子細(xì)胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個(gè)拷貝。（3酵母人工染色體該載體在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有單拷貝。在細(xì)胞分裂和遺傳過(guò)程中，能將染色體載體均勻分配到子細(xì)胞中，并保持相對(duì)獨(dú)立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標(biāo)記基因赭石突變抑制基因SUP4表達(dá)時(shí)菌落呈白色，不表達(dá)時(shí)呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達(dá)研究。第十一章1原核細(xì)胞表達(dá)真核基因的障礙和措施：障礙：1細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真和基因的啟動(dòng)子2從真和基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖核蛋白體上3真核基因中一般含有內(nèi)含子，而原核基因缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能切除內(nèi)含子，不能形成成熟的mRNA，不能表達(dá)真核蛋白。4表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。措施：（1）可以通過(guò)人工合成的方法或者從cDNA庫(kù)中獲取.（2）(2)需要在真核生物基因的上游加入SD序列.(3)使用原核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子.(4)如果人工合成某一蛋白質(zhì)的基因,需要考慮原核生物對(duì)密碼子的偏愛性.(5)為了防止原核生物分解目的蛋白可以考慮分泌表達(dá)和融合表達(dá)等方法.(6)需要較復(fù)雜翻譯后加工的蛋白質(zhì)最好不用原核細(xì)胞表達(dá).信號(hào)肽：(signalpeptide)是引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一段多肽，一般位于新合成肽鏈的N端，含有6～15個(gè)帶正電荷的非極性氨基酸，由于信號(hào)肽又是引導(dǎo)肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的一段序列，又稱開始轉(zhuǎn)移序列(starttransfersequence)。2um質(zhì)粒：：一個(gè)閉合環(huán)狀超螺旋DNA分子，長(zhǎng)約2um。在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一種模擬微生物?？捎糜谘芯炕蛘{(diào)控、染色體復(fù)制的理想系統(tǒng)，也可作為酵母菌轉(zhuǎn)化的有效載體，并組建基因工程菌YEP質(zhì)粒：含有釀酒酵母2um質(zhì)粒和DNA復(fù)制有關(guān)的部分或全部序列，是一種酵母附加體型質(zhì)粒。2基因工程疫苗種類主要包括基因工程亞單位疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等四種1、基因工程亞單位疫苗(geneengineeringsubunitvaccine)基因工程亞單位疫苗，主要是指將基因工程表達(dá)的蛋白抗原純化后制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)量高；②純度高；③安全性高；④用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。缺點(diǎn)：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。增強(qiáng)其免疫原性的方法：①調(diào)整基因組合使之表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu)②是在體外加以聚團(tuán)化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球③加入有免疫增強(qiáng)作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。2、核酸疫苗（nucleicacidvaccine）核酸疫苗或稱基因疫苗（genevaccine），指使用能夠表達(dá)抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：①易于制備；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多聯(lián)多價(jià)疫苗。缺點(diǎn)：①外源核酸是否會(huì)整合到染色體中引起癌變；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗體的產(chǎn)生，免疫耐受等。3、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）基因缺失活疫苗使用分子生物學(xué)技術(shù)去除與毒力有關(guān)的基因獲得的缺失突變毒株制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：①有突變性狀明確、穩(wěn)定；②不易返祖、毒力恢復(fù)；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途徑。缺點(diǎn)：免疫效率、低用量大。5、蛋白工程疫苗（proteinengineeringvaccine）蛋白工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點(diǎn)突變、插入、缺失、構(gòu)型改變，甚至進(jìn)行不同基因或部分結(jié)構(gòu)域的人工組合，以期達(dá)到增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性，擴(kuò)大反應(yīng)譜，去除有害作