微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課件

到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)微生物的類(lèi)群原生生物原核生物真菌病毒如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲(chóng)、單細(xì)胞藻類(lèi)等微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞專(zhuān)題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)梳理一.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專(zhuān)供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來(lái)分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。（2）按成分來(lái)分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。（3）按功能來(lái)分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（一）分類(lèi)：(微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))(1)固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基①固體培養(yǎng)基：（觀察菌落和分離提純微生物）在一般培養(yǎng)溫度下呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。一類(lèi)是用天然的固體狀物質(zhì)制成的，如用馬鈴薯塊、麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉制成的培養(yǎng)基，酒精廠、釀造廠等常用這種培養(yǎng)基；另一類(lèi)是在液體中添加凝固劑而制成的，如實(shí)驗(yàn)室中常用的瓊脂固體斜面和固體平板培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基廣泛用于微生物的分離、鑒定、保藏、計(jì)數(shù)及菌落特征的觀察等。②液體培養(yǎng)基或培養(yǎng)液或發(fā)酵液：（工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)）呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布均勻，與菌體表面接觸充分，還能大量溶解微生物的代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于微生物的生理、代謝研究以及大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中。③半固體培養(yǎng)基：（觀察微生物的運(yùn)動(dòng)）

加入少量的凝固劑(如0.2％～0.5％的瓊脂)而制成的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基常用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、厭氧菌的分離和菌種鑒定等。幾種菌落及其形態(tài)（2）天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基①天然培養(yǎng)基：（工業(yè)生產(chǎn)降低成本）主要取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取。其優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好，缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，來(lái)源受限。天然培養(yǎng)基/液的種類(lèi)很多，包括生物性液體（如血清）；組織浸液（如胚胎浸液）；凝固劑（如血漿）等。②合成培養(yǎng)基：（菌種的分類(lèi)，鑒定，營(yíng)養(yǎng)、代謝，遺傳、鑒定和生物測(cè)定等定量要求較高的研究）是通過(guò)順序加入準(zhǔn)確稱(chēng)量的高純度化學(xué)試劑與蒸餾水配制而成的。其所含的成分（包括微量元素在內(nèi)）以及他們的量都是確切可知的。（三）選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基：①選擇培養(yǎng)基：配制特點(diǎn)：添加或減少某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)所需微生物的生長(zhǎng)。從而使后者從含有雜菌的標(biāo)本中分離出。（即篩選你所需要培養(yǎng)的微生物，令其生長(zhǎng)，其余微生物不生長(zhǎng)）例如：(1)基本的培養(yǎng)基通過(guò)加青霉素，實(shí)現(xiàn)分離純化酵母菌、霉菌；

（2）加高濃度的食鹽分離純化金黃色葡萄球菌（有高度的耐鹽性，可在10~15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)）

（3）無(wú)氮培養(yǎng)基可分離純化固氮菌（固氮細(xì)菌）。

（4）不含有機(jī)碳的培養(yǎng)基可分離純化自養(yǎng)型細(xì)菌如硝化細(xì)菌。

例1、下列物質(zhì)可作為培養(yǎng)硝化細(xì)菌碳源、氮源和能源的依次是

（

）A含碳無(wú)機(jī)物、氨、氨

B含碳無(wú)機(jī)物、氮、硝酸鹽C含碳有機(jī)物、氨、光

D含碳有機(jī)物、硝酸鹽、氨例2、要將土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）與其它細(xì)菌分離出來(lái)，應(yīng)將它們接種到（

）A．加入指示劑的鑒別培養(yǎng)基

B．含有蛋白胨的固體培養(yǎng)基C．沒(méi)有有機(jī)氮的選擇培養(yǎng)基

D．營(yíng)養(yǎng)要素全面的液體培養(yǎng)基練一練AC例3、某同學(xué)在做微生物實(shí)驗(yàn)時(shí)，不小心把原褐固氮菌和酵母菌混在一起，為了得到純度較高的酵母菌，配制好的培養(yǎng)基中應(yīng)再加入

（

）A．高濃度的食鹽

B．硝酸鹽C．伊紅美藍(lán)溶液

D．青霉素例4、在培養(yǎng)金黃色葡萄球菌時(shí)污染了青霉菌，青霉菌菌落周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)金黃色葡萄球菌不能生存。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是

（

）A．青霉菌和金黃色葡萄球菌之間的關(guān)系為競(jìng)爭(zhēng)B．要保留金黃色葡萄球菌，可用含高濃度食鹽的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇C．若金黃色葡萄球菌仍然生存，可能發(fā)生了抗青霉素的基因突變D．補(bǔ)充適合金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)能保存該菌DD微生物需要的四大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì)是：（三）培養(yǎng)基的構(gòu)成1.碳源2.氮源3.無(wú)機(jī)鹽4.水凡是能為微生物提供所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。①無(wú)機(jī)碳源：CO2；NaHCO3；碳酸鹽等②有機(jī)碳源：糖類(lèi)、脂肪酸、蛋白質(zhì)、花生粉餅、石油等⑴概念⑵來(lái)源：⑶不同微生物所利用的碳源不同：1.微生物的碳源異養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳有機(jī)物（有機(jī)碳）自養(yǎng)型微生物的碳源為：含碳無(wú)機(jī)物（無(wú)機(jī)碳）①無(wú)機(jī)氮源：N2、NH4+氨鹽、NO3-硝酸鹽、NH3。②有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁㎞元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.微生物的氮源⑴概念：⑵來(lái)源：⑶固氮微生物所利用的氮源是：3.特殊要求培養(yǎng)基還需要滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物）如維生素、某些氨基酸、堿基)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。氮?dú)馓荚?、氮源、生長(zhǎng)因子的比較來(lái)源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖類(lèi)、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類(lèi)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是異養(yǎng)生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分1.無(wú)菌范圍：①實(shí)驗(yàn)操作空間,操作者的手、衣著消毒.②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。③為避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行.④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲废嘟佑|.超凈工作臺(tái)二.無(wú)菌技術(shù)：防止外來(lái)雜菌的污染耐高溫需保持干燥的物品，160～170℃1～2小時(shí)接種環(huán)、接種針等金屬用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121℃、15～30min2.消毒與滅菌：灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱(chēng)量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱(chēng)量紙稱(chēng)取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱(chēng)量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：1mol／lNaoH調(diào)制微堿5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體，就是菌落倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.純化的方法：（1）平板劃線法：通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫(huà)線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，在數(shù)次畫(huà)線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。（2）稀釋涂布平板法：將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)缓髮⒉煌♂尪鹊木悍謩e涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞將試管口通過(guò)火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。.將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置劃3個(gè)平板1個(gè)不劃線（空白對(duì)照）問(wèn)題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。6支試管，分別加入9ml無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：