微生物的生長繁殖與控制

微生物的生長繁殖與控制第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日生物個體由小到大的增長，即表現(xiàn)為細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加生長指生物個體數(shù)目的增加繁殖由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況

個體生長個體繁殖群體生長

群體生長=個體生長+個體繁殖個體生長——微生物細(xì)胞個體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個體生長。群體生長——群體中個體數(shù)目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。2第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)微生物分離和純培養(yǎng)平板劃線分離法稀釋倒平板法單孢子或單細(xì)胞分離法利用選擇性培養(yǎng)基分離法純培養(yǎng)(pureculture)：微生物學(xué)中把從一個細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代，稱純培養(yǎng)。3第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.平板劃線分離法

用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。4第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.稀釋倒平板法5第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日6第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.單孢子或單細(xì)胞分離法采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。在顯微鏡下使用單孢子分離器進行機械操作，挑取單孢子或單細(xì)胞進行培養(yǎng)。也可以采用特制的毛細(xì)管在載玻片的瓊脂涂層上選取單孢子并切割下來，然后移到合適的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。7第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日4.選擇性培養(yǎng)基分離法各種微生物對不同的化學(xué)試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制合適某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。微生物純培養(yǎng)分離方法的比較分離方法應(yīng)用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細(xì)菌稀釋倒平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細(xì)胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的微生物8第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)微生物的生長規(guī)律一、細(xì)菌群體生長規(guī)律

在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個培養(yǎng)液體積不變條件下，以時間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時間時細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。生長曲線9第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日生長曲線可分：延滯期對數(shù)期衰亡期穩(wěn)定期10第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.延滯期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零，也稱延遲期、適應(yīng)期。特點：分裂遲緩、代謝活躍①通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；②利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為“種子”；③盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；④適當(dāng)擴大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良的影響。11第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.對數(shù)期對數(shù)生長期的細(xì)菌個體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速、代時穩(wěn)定，所以是研究微生物基本代謝的良好材料。它也常在生產(chǎn)上用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟效益。以最大的速率生長和分裂，細(xì)菌數(shù)量呈對數(shù)增加。細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，表現(xiàn)為平衡生長。12第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.穩(wěn)定期由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細(xì)菌生長，導(dǎo)致生長速率降低直至零(即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)量)，結(jié)束對數(shù)生長期，進入穩(wěn)定生長期。原因：獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物采取措施：補充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等13第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日4.衰亡期細(xì)菌代謝活性降低，細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶，產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌變成陰性反應(yīng)等。該時期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會使細(xì)菌死亡的速率降低?，F(xiàn)象：特點：14第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、生長的數(shù)學(xué)模型由一個細(xì)胞分裂成為兩個細(xì)胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間?！镏笖?shù)生長可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由試驗獲得，n可通過上式計算得出，將等式兩側(cè)取對數(shù)重排后得：lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgB

lg20.301n==15第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)4h（

t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，還可以計算出不同培養(yǎng)條件下的代時G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時為20分鐘。在4小時內(nèi)共繁殖了12代。16第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日一些細(xì)菌的代時菌名 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 代時E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌） 肉湯或牛奶37 16~18 E.aerogenes 組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉湯 37 48Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 120017第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、同步培養(yǎng)

1.概念是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時進行生長或分裂的群體細(xì)胞。同步生長：以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式同步培養(yǎng)物常被用來研究在單個細(xì)胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它是一種理想的材料。18第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.同步培養(yǎng)方法機械方法環(huán)境條件控制技術(shù)離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法溫度培養(yǎng)基成份控制光照和黑暗交替培養(yǎng)19第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日硝酸纖維素濾膜法離心法20第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。

連續(xù)培養(yǎng)的基本原則：微生物培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)類型恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng)21第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.恒化連續(xù)培養(yǎng)在整個培養(yǎng)過程中通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度基本恒定的方式，保持細(xì)菌的比生長速率恒定，使生長“不斷”進行。生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，生長因子等物質(zhì)。恒化器連續(xù)培養(yǎng)通常用于微生物學(xué)的研究，篩選不同的變種。22第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日23第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長連續(xù)進行的一種培養(yǎng)方式。用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)24第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日25第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；便于自動控制；降低動力消耗及體力勞動強度；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；缺點：雜菌污染和菌種退化26第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)環(huán)境因素對微生物的影響一、環(huán)境對微生物生長的影響影響因素：氧溫度pH值27第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日(一)溫度根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生長溫度范圍。

微生物類型

生長溫度／℃最低最適最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580超嗜熱或嗜高溫微生物6580-90100以上最適生長溫度：某菌分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度28第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日(二)pH微生物最低pH最適pH最高pH細(xì)菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8微生物生長過程中機體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個最適生長的pH范圍。29第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日(三)氧根據(jù)氧與微生物生長的關(guān)系可將微生物分為：好氧微好氧耐氧型兼性厭氧專性厭氧微生物類型最適生長的O2體積分?jǐn)?shù)好氧微好氧氧的忍耐型兼性厭氧專性厭氧等于或大于20％2％-l0％2％以下有氧或無氧不需要氧、有氧時死亡30第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日31第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日自由基是一種強氧化劑，它與生物大分子互相作用，可導(dǎo)致產(chǎn)生生物分子自由基，從而對機體產(chǎn)生損傷或突變作用，直至死亡。氧之所以對專性厭氧微生物以外的其他四種類型微生物不產(chǎn)生致死作用，是因為它們具有超氧物歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最終分解成水。氧對于好氧微生物生長雖然可以通過好氧呼吸產(chǎn)生更多的能量，滿足機體的生長需要，但另一方面，氧對一切生物都會使其產(chǎn)生有毒害作用的代謝產(chǎn)物，如超氧基化合物與H2O2，這兩種代謝產(chǎn)物互相作用還會產(chǎn)生毒性很強的自由基OH.。32第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日生物體中超氧陰離子的形成與去除O2+e O2·(·O2)超氧陰離子在細(xì)胞內(nèi)可由酶促或非酶促形成。超氧物陰離子歧化酶是在生物進化中發(fā)展出來的一種自我保護方式。 H2O+O22O2·+2H+ O2+H2O2 2H2O12SOD好氧生物和耐氧細(xì)菌過氧化氫酶好氧生物過氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌33第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、微生物生長的測定評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律；評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；微生物生長34第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日微生物生長測量方法個體計數(shù)法重量法生理指標(biāo)法35第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.計數(shù)法a.直接計數(shù)利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；36第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日該方法是教學(xué)、科研、生產(chǎn)常用的一種測量細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品及其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽孢與孢子等均可用此法測量。每毫升原菌液活菌數(shù)=培養(yǎng)皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5菌落形成單位：CFU/ml(/g)b.間接法（活菌計數(shù)法）原理是每個活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。37第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.重量法通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；蛋白質(zhì)總量=含氮量×6.25細(xì)胞總量=蛋白質(zhì)總量÷65%≈蛋白質(zhì)總量×1.54每個細(xì)菌DNA含量相當(dāng)恒定,平均為8.4×10-5ng。以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；1mg干菌體=4-5mg濕菌體=4-5×109個菌體測定多細(xì)胞及絲狀真菌生長情況的有效方法。38第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.生理指標(biāo)測定法樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。常用于對微生物的快速鑒定與檢測。微生物的生理指標(biāo)，如呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體生長的規(guī)模成正相關(guān)。39第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日第四節(jié)微生物生長繁殖的控制一、基本概念防腐(antisepsis)：在某些化學(xué)物質(zhì)或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施消毒(disinfection)：利用某種方法殺死或滅活物質(zhì)或物體中所有病原微生物的一種措施滅菌(sterilization)：指利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內(nèi)的所有微生物的一種措施化療(chemotherapy)：利用具有選擇毒性的化學(xué)物質(zhì)如磺胺、抗生素等對生物體內(nèi)部被微生物感染的組織或病變細(xì)胞進行治療，以殺死組織內(nèi)的病原微生物或病變細(xì)胞，但對機體本身無毒害作用的治療措施。40第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、控制微生物的化學(xué)物質(zhì)

1.抗微生物劑是一類能夠殺死微生物或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)。抑菌劑

殺菌劑溶菌劑結(jié)合到核糖體上抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致生長停止，由于它們同核糖體結(jié)合不緊，它們在濃度降低時又會游離出來，核糖體合成蛋白質(zhì)的能力恢復(fù)，使生長恢復(fù)緊緊地結(jié)合到細(xì)胞的作用靶上，即使在濃度降低時也不能游離出來，因此生長不能恢復(fù)能抑制細(xì)胞壁合成或損傷細(xì)胞質(zhì)膜41第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗微生物劑通常又將它們分為：消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對人及動物的體表組織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。HgCl2、CuSO4、碘液、氯氣、乙烯氧化物、甲醛劑、臭氧有機汞、0.1%-1％硝酸銀、碘液、70%乙醇、3％過氧化氫42第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日各種抗微生物化學(xué)制劑殺菌能力的比較標(biāo)準(zhǔn)：石炭酸系數(shù)：指在一定時間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度和達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。在臨床上最早使用的消毒劑----石炭酸43第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日2.抗代謝物(Antimetabolite)有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進行，這些物質(zhì)稱為抗代謝物。葉酸對抗物（磺胺）、嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）、苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）、尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）44第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日磺胺藥物對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌（如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等）、某些革蘭氏陰性細(xì)菌（如痢疾桿菌、腦膜炎球菌、流感桿菌等）、對放線菌也有一定的作用。作用機理：磺胺是葉酸組成部分對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物。磺胺對人體細(xì)胞無毒性，因為人缺乏從對氨基苯甲酸合成葉酸的相關(guān)酶----二氫葉酸合成酶，不能用外界提供的對氨基苯甲酸自行合成葉酸，而必須直接利用葉酸為生長因子進行生長。45第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.抗生素

抗生素(Antibiotic)是由某些生物合成或半合成的一類次級代謝產(chǎn)物或衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或影響它種生物的生命活動，如殺死微生物或抑制其生長。(1)概念自本世紀(jì)40年代以來，已找到上萬種新抗生素，合成了近10萬種半合成抗生素，但其中在臨床上常用的僅幾十種。46第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日(2)作用機制抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成破壞細(xì)胞質(zhì)膜作用于呼吸鏈以干擾氧化磷酸化抑制蛋白質(zhì)和核酸合成47第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日48第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日(3)細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生抗性菌株特點：細(xì)胞質(zhì)膜透性改變，使抗生素不進入細(xì)胞或進入細(xì)胞后被細(xì)胞主動排出；藥物作用靶改變；合成了修飾抗生素的酶；抗性菌株發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致合成新的多聚體，以取代或部分取原來的多聚體；49第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日(4)應(yīng)用抗生素注意(1)第一次使用