三七提取物深加工制備中藥藥物方法應(yīng)用工藝專利技術(shù)文集皂苷r1的用途

(19)(19)民國(guó)家知局(21)(22)

(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN(43)(71)申請(qǐng)人師范大地址100875市海淀區(qū)新街口外大19申請(qǐng)人師大科技園科技發(fā)展(72)發(fā)明人(74)專利機(jī)構(gòu)集佳知識(shí)有公司A61K31/704A61P25/28權(quán)利要求權(quán)利要求書1頁說明書18頁序列表1頁附圖9頁(57)A的用途。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明NTR1可改善APP/PS1轉(zhuǎn)AD小鼠的認(rèn)知與學(xué)習(xí)能力，回復(fù)其腦內(nèi)ChAT水平，降低腦內(nèi)丙二醛水平，通過提高CcO活性，從而提高AD小鼠線粒體功能。并且，NTR1還可以提高IDE從而促進(jìn)Aβ的降解七皂苷R1在治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。并且通過實(shí)證實(shí)三七皂苷R1在0μmol/L～500μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性ACN

權(quán)利要求 1/1脂脂 中的主要有效成分是三七總皂苷(PanaxNotoginsengSaponinsPNS)包括多種單體皂苷，R1NTR1如式I所示，[0004]，NTR1[0005]190NTR1究。研究稱NTR1在多種血管相關(guān)細(xì)胞具有促進(jìn)纖維蛋白溶解系統(tǒng)合成的作其作用機(jī)制可能是通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素和中性白細(xì)胞CD18蛋白表達(dá)的抑制。另一項(xiàng)研究表NTR1可在細(xì)胞水平通過抑ERK以及NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS生成TNF-a抑制人全血細(xì)胞培養(yǎng)中LPS引起的TNF-a的升高。的研究發(fā)在脂多糖誘導(dǎo)的心臟功能小鼠模型中，NTR1可抑制NF-κB通路的炎癥因子減輕心肌的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。這一作用可能是通過上調(diào)了雌激素受體a（ERa）PI3K/Akt通路。 的花費(fèi)約占到全球GDP總值的1%。阿爾茨海默病(Alzheimer`sDisease,AD)， 等。AD的病因十分雜，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。ADplaque,SP 本發(fā)明提供了三七皂苷R1在促進(jìn)ChAT或CcO活性及表達(dá)水平中的應(yīng)用。 ChAT切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平降低會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)功能。CcO即細(xì)胞色素C氧化NTR1 [0014]丙二醛（MDA是細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，可作為氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證NTR1能夠劑量依賴性的降低APP/PS1小鼠皮層內(nèi)MDA水平NTR1可降低APP/PS1小鼠的氧化應(yīng)激水平。[0016]NTR1能夠劑量依賴性APP/PS1小鼠皮層內(nèi)線CcO活性CcO處N2a-APP695sw細(xì)胞IDE蛋白NTR1濃度梯度NTR1處理神經(jīng)元?jiǎng)┝恳蕾嚨卮龠M(jìn)神IDE蛋白的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，NTR1能夠提高APP/PS1小鼠腦皮層內(nèi)IDE的mRNA及蛋白水平。從而證R1能夠促進(jìn)細(xì)胞或組織中IDE的表[0019]本發(fā)明還提供了三七皂苷R1在Aβ降解促進(jìn)劑或Aβ積累抑制劑中的應(yīng)用。[0020]Aββ4042AD的成分具有神經(jīng)細(xì)胞毒性是AD致病因一。由APP蛋白經(jīng)β-分泌酶和γ-分（IDE（NEPN2a-APP695sw胞外分泌的Aβ1-40和Aβ1-42水平。AD小鼠的認(rèn)知與學(xué)習(xí)能力回復(fù)其腦內(nèi)ChAT水平降低腦內(nèi)丙二醛水平通過提高CcO活性，從而提AD小鼠線粒體功能。并且，NTR1還可以提IDE水平，從而促Aβ的降解并抑制Aβ的積累。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了三七皂苷R1在治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。并且通過實(shí)驗(yàn)R1在0μmol/L～500μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì) 申組1～5天隱蔽平臺(tái)逃避潛伏期5示正常對(duì)1～5天隱逃避潛伏期變化

（P<0.05，

避潛伏期變化；3（b3（d 4（d）NTR1APP/PS1ChAT 層ChAT的Westernblot檢測(cè)顯影圖，圖5（b示以GAPDH為對(duì)照各組小鼠皮層中ChAT

（P<0.05，

，小鼠皮IDE蛋白Westernblot檢測(cè)顯影圖，圖6（b）示β-actin為對(duì)照各組小鼠皮層中IDE蛋白的相對(duì)含量示與模型對(duì)照組相比存在顯著性差（P<0.05）；，，IDEmRNArtPCR產(chǎn)物的7（b）示β-actin為對(duì)照各組小鼠皮IDEmRNA，相對(duì)表達(dá)量

示與模型對(duì)照組比較存在顯著性差 示與模型對(duì)照組NTR1APP/PS1Aβ，[0035]9示不同濃NTR1N2a-APP695swPPARγp-PPARγ蛋白水平的影9（a示經(jīng)不同濃NTR1處理的N2a-APP695sw細(xì)胞中PPARγp-PPARγ及對(duì)照β-actinwesternbolt顯影圖，圖9（b示以β-actin為對(duì)照同濃度NTR1處N2a-APP695sw細(xì)胞PPARγ相對(duì)9（c）示β-actin照，經(jīng)不同濃度NTR1N2a-APP695swp-PPARγ相對(duì)含量示與未加NTR1，在顯著性差 示與未加NTR1處理的細(xì)胞相比存在極顯著性差（P<0.01 圖10NTR1N2a-APP695swERK1/2p-ERK1/2ERK1/2

11NTR1N2a-APP695swIDE顯影圖圖 b，，

，，1（aIDE相對(duì)含量示與未加NTR1處理的細(xì)胞相比存在顯著性差（P<0.05）示與未加NTR1（P<0.01。，，究所，2月齡，雄性（證號(hào)：SCXK(京)2005-0013。APP/PS1轉(zhuǎn)AD模型小鼠為具有APP和PS1雙突變的小過量生成Aβ是常見的AD小鼠模型之，3月齡出現(xiàn)學(xué)習(xí)功能5月齡出現(xiàn)老年斑。小鼠飼養(yǎng)于師范大學(xué)教育部天然藥物功能中心SPF級(jí)動(dòng)物（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用證號(hào)：SYXK（京）2009-0010。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過師范大[0044]克隆胎牛購(gòu)自PAA公司 HumanAβ40ELISAKit和HumanAβ42ELISAKitInvitrogen[0047]3KDaMillipore DMEM（HGIBCOERK1/2p-ERK1/2抗體購(gòu)于Abcam公司。膽堿乙酰轉(zhuǎn)（ChAT）抗體磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）SantaCruzBiotechnology[0051]NTR1購(gòu)于澤朗科技，純度>98%，批號(hào)ZL RIPA 80%。123APP/PS1小鼠隨機(jī)分為5每組10只。分別為對(duì)照組安理申陽性對(duì)照組NTR1低劑量組、NTR1高劑量組以及C57正常對(duì)照組5組小鼠每天同一時(shí)間進(jìn)行灌胃給灌胃4個(gè)月7月齡進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)和AD神經(jīng)損傷相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。各組處理給藥劑量如表1所示：[0063]表1各組小鼠給藥劑量 [0066]水迷宮位于SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)。水迷宮直徑120cm，隱蔽平臺(tái)直徑10cm，頭掛于水迷宮上方。室內(nèi)光線不直射水面22±1鈦白粉染成不透明白色；秒未找到平臺(tái)引導(dǎo)其找到平同樣停留15之后將其輕柔地取出放回籠內(nèi)。小鼠找到隱蔽平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期（Escapelatency。 T-testp<0.052 （9.10±1.04s在掌握測(cè)試內(nèi)容及平臺(tái)位置上始終顯得遲鈍，具有認(rèn)知/，表現(xiàn)為第五天的逃避潛伏期仍大于30s（31.26±5.41s。而低劑量和高劑量的NTR1均顯著縮短了APP/PS1小鼠的逃避潛伏期，第五天時(shí)它們的逃避潛伏期（17.03±2.87s，13.28±1.99s）接近陽性對(duì)照安理申組（14.05±2.16s表現(xiàn)出很強(qiáng)的改善學(xué)習(xí)水中均表現(xiàn)出改善水平的作用。比起APP/PS1模型組小鼠，NTR1低劑量和高劑量的原（1.50±0.27vs2.50±0.342.70±0.40（24.50%±3.16%vs29.76%±3.6436.71%±4.26%使APP/PS1小鼠的空間認(rèn)知/學(xué)習(xí)能力得到改善。 （12h（12h（12h（12h次)脫水。脫水在4℃進(jìn)行。 30min15min液繼續(xù)透明15min至外層組織呈半透明狀態(tài)。透明在4℃進(jìn)行并應(yīng)避免透明過渡。 組織浸蠟將透明后的組織用吸水紙吸掉過多的二甲苯放入熔化的石蠟中在65℃溫箱中放置2h～3h。 37℃溫箱中烤片24h以上。 15min2100醇各15min295乙醇15min80705010min3份蒸餾水各3min。20min3min。35min。用濾紙吸干液體，用組化筆圈組織。Triton10（0.5%37℃溫箱中30min。 盒4℃孵育過夜第二天從濕盒中取出置染缸中用PBS洗三次每次5min濾紙吸干 二抗/三抗反應(yīng)按試劑盒說明書操作。 中10min，然后浸泡于蒸餾水中。 3s 5min3min 37℃干燥。 3ChATWestern[0098]樣品（TrispH6.82%SDS10DTT0.1WesternBlot（10020mn160V0min（295mA90minChA（1:200GAPD（1:200）置搖4℃孵育過夜 旋震蕩15s。4℃3000g離心20min取上清液。BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度后稀釋至50μg/ml。之后按照說明書進(jìn)行操作至顯色用紫外分光光度（島津UV-2450）532nm波OD532值。預(yù)冷的分（試B）勻漿，然41500g10min。取上10000g離 HclpH7.0120ma10s1min。空白對(duì)照值是用不含線粒體的體系測(cè)得。 T-testp<0.05為差異顯著性。 棕色為陽性（標(biāo)尺為40μM）；小鼠皮層ChAT的Westernblot結(jié)果如圖5（A）所示，CcOMDA3 從免疫組化結(jié)果中可以看出7月齡的C57小鼠皮層上有豐富的表明C57小鼠皮層的ChAT處于較高水平而同齡的APP/PS1小鼠腦切片中只有零星的說明其皮NTNNTR1小鼠皮層內(nèi)ChAT水平對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。 APP/PS1vs3.60±0.09nmol/mgmg2.82±0.08nmol/mg。說明NTR1可降低APP/PS1小鼠整體的氧化應(yīng)激水平。 線粒體CcO活性檢測(cè)結(jié)果表明，APP/PS1小鼠皮層線粒體CcO活性顯著降低（0.27±0.01μmol/mg/minC57（0.68±0.01μmol/mg/min）的40高劑量的NTR1大幅提高了APP/PS1小鼠CcO（0.41±0.02μmol/mg/min具有顯著性差異。[0126]以上結(jié)果說明，NTR1CcO 采用Westernbolt的方法分析實(shí)施例2中凍存的經(jīng)水迷宮實(shí)驗(yàn)的小鼠皮層組織內(nèi)的IDE蛋白含量并用rtPCR的方式對(duì)小鼠皮層內(nèi)IDEmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析。 1小鼠皮層IDE蛋白的Westernblot 樣品蛋白酶抑制劑和1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液200μL電動(dòng)勻漿器冰浴勻漿行超（功21。于4℃低溫離心12000rpm10min取上清BCA測(cè)定蛋白濃度并用裂解液調(diào)齊蛋白濃度。加入與樣品等體積的2×LoadingBuffer（20mMTrispH6.82%SDS10甘油0.1MDTT0.1%溴酚藍(lán)置于100℃金屬浴中5min。-20℃凍存以備后續(xù)Western實(shí)驗(yàn)使用。WesternBlot（10020mn160V0min（295mA90minIDE（1:500β-置搖4℃孵育過夜IRDye800CW（1:10000（. [0147]RNApreppureRNARNA。具體操作如下，從-80℃冰箱中取出凍存的皮層組織樣入干凈EP管中個(gè)樣品中加入300μL裂（含1%β-巰基乙醇。置于冰用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行可見組織塊為止。再加入590μLRNase-freeddH2O10μL蛋白酶K56℃孵育20min12000rpm離心5min取上清0.5倍上清體積無水乙醇，混勻。將此溶液加入吸附柱中，12000rp離心1min附柱中加入350μL12000rp離心1min再加入80μLDNase15min。加500μL漂洗液室溫2min12000rp離心1min。此步驟重復(fù)一次。12000rpm離心2min打開吸附柱其徹底晾干。將吸附柱轉(zhuǎn)至干凈RNase-freeEP管中，加入50μLRNase-freeddH2O室溫放置2min12000rpm離心2min。得到的RNA溶液-80℃保存。[0148]RNARNAOD260nm/OD280nm=OD260nm×40[0149]RT-PCR[0150]RevermoFirstStrandcDNASynthesisKit（ThermoRNARNA1μ12μL。65℃5min。再PCR管中加入其它反應(yīng)4μL5×ReactinBuffer，inhibitor(20U/μL2μL10mMMix1μL42℃60mi5m后的cDNA可-20℃保存。[0151]IDEPCRPCR 1μL5μL2×TaqPCRMix（天根公司[0160]（mean±S.E.）SPSS13.0T-testp<0.0576大幅降低了一倍左而經(jīng)NTR1灌胃處理后的APP/PS1小鼠的IDE出現(xiàn)了（升高約60%。說明NTR1提高了IDE的蛋白水平。進(jìn)一步地，RT-PCR（圖7APP/PS1小鼠皮層內(nèi)IDEmRNA水平降NTR1低、高劑量（P0.05）提高IDEmRNA水平。該結(jié)果與IDEWesternblot結(jié)果相一致。說明NTR1可調(diào)節(jié)APP/PS1小鼠皮層內(nèi)IDE的 實(shí)施例4三七皂苷R1對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ積累的影響 通過免疫組化分析ELISA實(shí)施例2中凍存的經(jīng)水迷宮實(shí)驗(yàn)的小鼠腦組織中Aβ40及Aβ42的含量。 15min2100醇各15min295乙醇15min80705010min3份蒸餾水各3min。20min3min。35min。用濾紙吸干液體，用組化筆圈組織。Triton10（0.5%37℃溫箱中30min。 盒4℃孵育過夜第二天從濕盒中取出置染缸中用PBS洗三次每次5min濾紙吸干 二抗/三抗反應(yīng)按試劑盒說明書操作。 5min3min 37℃干燥。 ImageJ軟件進(jìn)行斑塊數(shù)量和面積的分析。結(jié)果如表4所示。 84.81802020.125%±0.013% pH8.1600KCl0.2g/LKH2PO48.0g/LNaCl1.150g/L5%BSA0.003%Tween- AβELISAHμManAβ40ELISAKit和HμManAβ42ELISAKitAβ平。具體操作如下： DiluentBuffer 0pg/mL7.81pg/mL15.62pg/mL31.25pg/mL62.5pg/mL125pg/mL250pg/mL500pg/mL 0pg/mL15.62pg/mL31.25pg/mL62.5pg/mL125pg/mL250pg/mL500pg/mL1000pg/mL 50μLAβ1-40或Aβ1-42檢測(cè)一抗（Aβ40/Aβ42DetectionAntibody。4℃放置過夜。在紙上扣板以盡量除去漂洗液。重復(fù)漂洗5次。應(yīng)30min。]nzidine(TMB)。將孔板放置于水平搖避光顯色10～30min。顯色至各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品Solution的相OD450nmAβ40Aβ42（pg/mL）為橫坐標(biāo)OD450nm值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由各樣品OD450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲Aβ40與Aβ42的水（pg/mL。此結(jié)果再除以各樣品的蛋而得mg蛋白樣品中所含有的Aβ40與Aβ42的水（pg/mgprotein。結(jié)果如表5所示。[0197]5APP/PS1Aβ1-40Aβ1-42水平極大地超過正常C57小鼠腦NTR1低、高劑量處理后，APP/PS1小鼠皮層和海馬中兩種長(zhǎng)度的Aβ均呈梯度高劑量組的降低幅度超過了一倍。另外NTR1不影響Aβ42/Aβ40的比例。[0199]5R1N2a-APP695swPPARγ[0200]取購(gòu)自師范大學(xué)教育部天然藥物工程中心的N2a-APP695sw細(xì)胞，使用含有5%克隆胎牛，500ug/LG4181%GlutaMADMEM（H）OPTI-MEM等體積混合的培養(yǎng)基，在37℃恒溫，5CO2902～3WesternBlot（0V0n10Vin （1:500p- （1:500p-NTR110μM100μMp-ERK蛋白水平。[0215]5N2a-APP695sw5×104的密度種于12孔板每孔1mL。37℃培養(yǎng)48h。換成不同濃度的NTR1（終濃度分別為01、buffer進(jìn)行刮樣品0.5mLEP100℃金屬5min單離心20℃?zhèn)溆?。[0216]參照實(shí)施例5中所述的WesternBlotIDE（1:500β-（1:2000W0IRDye800C（1:10000。對(duì)不同濃度NTR1處理后的N2a-APP695sw細(xì)胞中IDE水平進(jìn)行分析。結(jié)果如圖11所示。[0217]結(jié)果表明，經(jīng)0-100μM的NTR1處理8h后，N2aAPP695sw細(xì)胞的IDE蛋白隨NTR1濃度梯度10μM濃度下已與未處理具有顯著性100μM的NTR1使其IDE蛋白水平升高了約40%。 375%CO290 NTR1（1μM10μM100μMAEBSF4℃12000rpm4℃12000rpm HμManAβ40ELISAKit和HμManAβ42ELISAKitN2a-APP695sw胞的Aβ水平。具體操作如下： DiluentBuffer 07.8115.6231.2562.5125250500pg/mL 015.6231.2562.51252505001000pg/mL 2上樣及加一抗在ELISA孔板中每孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品稀釋液以及50μLAβ1-40或Aβ1-42檢測(cè)一（A