第五章 工業(yè)微生物誘變育種誘變劑

第五章工業(yè)微生物

誘變育種誘變劑

本章內(nèi)容微生物育種誘變劑微生物的誘變育種CompanyLogo誘變劑是指那些能誘發(fā)基因突變、并使突變率提高到超過自發(fā)突變水平的物理或化學(xué)因子。物理誘變劑種類化學(xué)誘變劑生物誘變劑第一節(jié)微生物育種誘變劑CompanyLogoCompanyLogo誘變育種的特點（1）提高突變率、擴大突變譜。（2）改良單一性狀比較有效，同時改良多個性狀較困難.

（3）性狀穩(wěn)定快，育種年限短。（4）誘發(fā)突變的方向和性質(zhì)尚難掌握。

CompanyLogo一、物理誘變劑包括紫外光、x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。其中紫外光沿用最廣，誘變抗生素高產(chǎn)突變株有很優(yōu)異的效果。非電離輻射：電子級能提高，但不產(chǎn)生離子。電離輻射:能擊中電子并產(chǎn)生正離子物理誘變主要是由于高能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過程。?？梢苑譃槲锢?、物理-化學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)階段(p35)。CompanyLogo（一）物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)直接作用間接作用擊中DNA或其它生物結(jié)構(gòu)引起的能量吸收環(huán)境中其它分子激發(fā)和電離分子激發(fā)和電離分子重排重排原初損傷擴散自由基分子的變化代謝代謝突變突變體生物變化細(xì)胞死亡物理物理-化學(xué)化學(xué)生物學(xué)CompanyLogo1、物理階段

持續(xù)時間極短（10-5~10-8秒）。電離輻射產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)形成電離效應(yīng)。2、化學(xué)階段持續(xù)時間極短（10-5~10-8秒）。形成大量的自由基。3、生物化學(xué)階段持續(xù)時間短（10~10-2秒）。大量的自由基與生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成大量的烷化自由基(R.)，將輻射效應(yīng)轉(zhuǎn)移到生物大分子中。烷化自由基持續(xù)時間長，并可通過繁殖傳遞。CompanyLogo4、生物學(xué)階段持續(xù)時間長（甚至幾個世代）,并可通過繁殖傳遞。烷化自由基(R.)與生物大分子發(fā)生一系列反應(yīng)，引起生理和遺傳損傷。4.1形態(tài)方面的表現(xiàn)損傷：造成死亡，死亡率與輻射劑量成正比生長：抑制生長等，與輻射劑量成正比形態(tài)變異：菌落（體）、色澤大小變化。生理變異：不能遺傳，逐漸消失。遺傳變異：能遺傳CompanyLogo4.2生理方面的表現(xiàn)生理方面的表現(xiàn)酶活性的變化POD（過氧化物酶）、SOD、CAT（過氧化氫酶）、核酸酶相關(guān)物質(zhì)含量的變化蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸生長素、ABA（天然脫落酸）

CompanyLogo4.3遺傳方面的表現(xiàn)細(xì)胞核方面的表現(xiàn):細(xì)胞核擴大、松散（膨松puffing）微核細(xì)胞，微核細(xì)胞率與輻射劑量成正比微核細(xì)胞率是評價遺傳損傷的指標(biāo)染色體方面的表現(xiàn):斷裂，形成染色體斷片、環(huán)、橋等。染色體畸變率與輻射劑量成正比染色體畸變率是評價遺傳損傷的指標(biāo)CompanyLogoDNA方面的表現(xiàn):DNA斷裂、分解，形成單鏈結(jié)構(gòu)DNA非按時合成存在自我損傷修復(fù)機制，提前進(jìn)行DNA合成，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)生長素類物質(zhì)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)咖啡因、EDTA等擬制DNA損傷修復(fù)CompanyLogo①菌種的遺傳背景和生理狀態(tài)；②可見光；③水分；④電離輻射誘變劑在氧氣或空氣中使用時，其輻射效應(yīng)一般要比在真空中或在惰性氣體中時要高；⑤溫度對電離輻射效應(yīng)也有影響，主要是能改變氧與自由基，或自由基相互間的作用程度。（二）影響輻射效應(yīng)的因子CompanyLogo1、性質(zhì)和來源波長在40一390nm之間。由于DNA分子的紫外光吸收值為260nm，因而波長在200-300nm的紫外光才有誘變作用。紫外光源一般要求為發(fā)射光譜集中在260nm附近的紫外光燈，燈管內(nèi)裝有氖氣的低壓放電燈是較理想的光源，國內(nèi)一般采用30瓦的紫外光燈，光譜分布范圍廣，誘變效率差。特點：能量較低；對組織穿透力強.（三）非電離輻射——紫外線CompanyLogo2、紫外光的劑量單位:爾格能量/mm2(燈具發(fā)射強度隨使用時間延長而下降。)實際應(yīng)用-相對劑量：照射時間、殺菌率來表示殺菌率：90.0%-99.9%時間：芽孢菌10min；小芽孢桿菌營養(yǎng)缺陷型1-3min；一般營養(yǎng)體3-5min；無芽孢菌和革蘭氏陽性菌0.5-2min。CompanyLogo3、誘變機理

嘧啶二聚體DNA鏈的斷裂胞嘧啶與尿嘧啶的水和作用DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)CompanyLogoCompanyLogo

出發(fā)菌株前培養(yǎng)；培養(yǎng)基豐富營養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)到

對數(shù)期、真菌孢子剛成熟；制備菌懸液：處理液均用生理鹽水制備。細(xì)菌調(diào)節(jié)菌液濃度到108個/ml，真菌約為106—107/ml，放線菌則為l07—108/ml.4、操作方法CompanyLogo

照射設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室、培養(yǎng)皿等;紫外燈：波長為253.7nm,功率是15W;處理時的照射距離：20cm—30cm;樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm,照射時，要用磁力攪拌器攪拌。注意：操作和培養(yǎng)時必需避免可見光直射液面，最好在黃色或紅色燈光下操作。

后培養(yǎng)：1.5-2小時；

稀釋涂皿CompanyLogo（四）、電離輻射CompanyLogo（五）新型誘變劑

微波:電磁波紅外線：0.75～1000μm激光：光量子流高能電子流：強電離輻射航天育種：利用返回式衛(wèi)星進(jìn)行農(nóng)作物新品種的選育的一種方法。CompanyLogo航椒1號航茄2號CompanyLogo航天葫蘆CompanyLogo6、低能離子注入過程：能量沉積、動量傳遞、離子注入和電荷交換時間：10－19－10－13s中間時發(fā)生。特征：具有Y射線能量沉積引起機體損傷的；動能交換產(chǎn)生的級聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)原子轉(zhuǎn)移、重排或基因的缺失；慢化離子、移位原子和本底元素復(fù)合反應(yīng)造成的化學(xué)損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉(zhuǎn)移造成的損傷。CompanyLogo常用離子：通常采用N+、H+、Ar＋。生物學(xué)效應(yīng)：相當(dāng)于物理和化學(xué)誘變兩者相結(jié)合的復(fù)合誘變效應(yīng)CompanyLogo化學(xué)誘變劑是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。堿基類似物烷化劑移碼突變劑其他類二、化學(xué)誘變劑種類CompanyLogo1、種類胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物（一）堿基類似物常用CompanyLogo腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物常用CompanyLogo鳥嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物CompanyLogo2、堿基類似物作用機制5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物也是一種強誘變劑。它滲入到DNA中，會發(fā)生酮式和烯醇式互變，不僅和原來的堿基配對而且和其它堿基配對。CompanyLogo例5-BU誘發(fā)A-T變?yōu)镚-C過程摻入到DNA的復(fù)制過程，堿基類似物又成為摻入誘變劑CompanyLogo3、各種堿基類似物的性質(zhì)和使用方法

性質(zhì)5-溴(氟)尿嘧啶(5-Bu，或5-Fu)為白色無味結(jié)晶粉末，溶于水或醇中，幾乎不溶于氯仿和乙醚。脫氧溴尿核苷(亦即溴脫氧尿核苷，5-BudR)，白色結(jié)晶狀粉末，無臭、無味，難溶于水和甲醇，易溶于堿性溶液。6-巰基嘌呤(6—MP)為黃色無臭結(jié)晶粉末，熔點313-314℃(當(dāng)即分解)，在空氣中或見光會發(fā)黑變質(zhì)，溶于乙醇，堿性溶液和稀硫酸，幾乎不溶于水、丙酮、氯仿和醚。CompanyLogo使用方法1）將待處理的細(xì)菌于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)期，離心去培養(yǎng)液。2）饑餓培養(yǎng)：生理鹽水8-10小時3)把5-Bu或5-Fu（一般劑量為5-300μg／ml，細(xì)菌25-40μg／ml）加到培養(yǎng)基中，做平板。4）涂皿菌體涂布在含一定濃度的堿基類似物的培養(yǎng)基平皿上，適溫培養(yǎng)，挑取菌落篩選。CompanyLogo(二)烷化劑烷化劑是一種常見的誘變劑，這類誘變劑具有一個或多個活性烷基，他們?nèi)菀兹〈鶧NA分子中的活潑氫原子，直接和一個或多個堿基起烷化反應(yīng)。85CompanyLogo1）單功能烷化劑：有一個烷化基團(tuán)，對生物毒性小誘變效應(yīng)大。2）雙功能或多功能烷化劑：有兩個或多個烷化基團(tuán)對生物毒性大，誘變效應(yīng)小。1、烷化劑種類CompanyLogo甲基磺酸甲酯MMSSCH3OCH3OOCH3SO2?OCH3SO2·

(OC2H5)2:硫酸二乙酯DMSCompanyLogo2、烷化劑作用機理EMS引起堿基轉(zhuǎn)換

CompanyLogo一般認(rèn)為甲基化比乙基化造成能造成更多的斷裂和缺失，所以MMS的毒性大于EMS。甲基黃磺酸乙酯EMSSCH3OC2H5OO甲基黃磺酸甲酯MMSSCH3OCH3OO烷化劑CompanyLogo3、常用烷化劑及其使用方法亞硝基胍（NG、NTG）黃色結(jié)晶、性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光分解。是一種特別強的誘變劑，有超誘變劑的稱號。還能誘發(fā)鄰近的基因同時發(fā)生突變，即并發(fā)突變。且易誘發(fā)復(fù)制叉附近并發(fā)突變。有微弱移碼作用,適于誘變營養(yǎng)缺陷型突變株(10%營養(yǎng)缺陷型)。CH3NNOCNHNHNO2CompanyLogoNTG在水溶液中隨著不同pH將產(chǎn)生不同的分解物，從而影響誘變效用.當(dāng)溶液pH低于5.5時，NTG分解成亞硝酸；當(dāng)溶液pH在8.0以上時，NTG會分解產(chǎn)生重氮甲烷，對核酸其烷化作用；當(dāng)溶液pH6.0時，NTG本身DNA其烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。CompanyLogoa、根據(jù)處理菌體特性，選用一定范圍pH值的緩沖液制備菌體或孢子懸液。再離心洗滌，除去培養(yǎng)液，然后用緩沖液制備孢子液。b、NG試劑要保存在冰箱內(nèi)，使用時要特別注意安全﹗﹗﹗操作要在通風(fēng)柜內(nèi)，帶上橡皮手套，穿上工作服，也不得將NG直接放在紙上暴露稱量。最好先準(zhǔn)備一只滅菌小瓶，在通風(fēng)柜中用小勺取15-30mg放入小瓶中稱重(現(xiàn)用現(xiàn)配)。NG難溶于水，可按10mg/1ml的比例加入丙酮溶解，再用緩沖液稀釋。NG使用注意事項﹗CompanyLogoc、取0.2mlNG處理液與2ml孢子液混合，在一定溫度下處理n分鐘;d、用緩沖液或生理食鹽水大量稀釋或多次離心洗滌處理后的混合液并稀釋到合適濃度，涂布平皿，分離培養(yǎng)。f、所有接觸過NG的器皿均須用l-2N的NaOH液解毒處理。要浸泡過夜并在陽光下曬。最好將接觸稀濃不同的NG液的器皿分別作解毒處理。CompanyLogo能和DNA分子結(jié)合，并造成其堿基對增多或缺失，從而誘發(fā)突變的化合物。包括壓吖啶類雜環(huán)染料以及一些烷化劑和吖啶類相結(jié)合的化合物，總稱為ICR類化合物。使用方法：用pH7.0磷酸緩沖液將吖啶黃配制成濃度為0.2%溶液，在28℃振蕩3—4小時使其完全溶解。直接加入孢子液接觸處理或加入培養(yǎng)基內(nèi)。如為生長過程處理，平皿內(nèi)濃度一般為10-50μg／ml的吖啶黃，處理時避光操作。(三)移碼誘變劑CompanyLogoDNA鏈上的兩個堿基插入移碼突變劑后，兩個堿基之間的距離變大，引起堿基缺失和插入CompanyLogo

羥胺：專一作用于胞嘧啶，改變了DNA上該堿基的結(jié)構(gòu)，以致在DNA復(fù)制過程中，結(jié)構(gòu)改變的胞嘧啶同腺嘌呤而不與鳥嘌呤配對，從而引起了堿基轉(zhuǎn)換G：C→A：T。羥胺（NH2OH）（白色晶體，具有腐蝕性）和其它誘變劑相比，只引起G:C轉(zhuǎn)變?yōu)锳:T,而不引起A:T轉(zhuǎn)變?yōu)镚:C。（四）羥胺劑CompanyLogoCGCGHAC*GC*ACGC*ATA羥胺和細(xì)胞內(nèi)其它物質(zhì)也能發(fā)生作用，生成過氧化氫。過氧化氫是非專一性誘變劑。對于噬菌體或離體DNA，羥胺是專一性很強的誘變劑，但對細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物，誘變效果不理想CompanyLogoCompanyLogo（五）脫氨劑-亞硝類誘變劑作用原理作用：通過氧化脫氨基造成的。胞嘧啶(C)經(jīng)氧化脫氨后成為尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)經(jīng)脫氨后成為次黃嘌呤(H)，鳥嘌呤(G)脫氨成為黃嘌呤(X)。CompanyLogoCompanyLogo

使用方法不穩(wěn)定，常用鹽類—亞硝酸鈉1、0.1M亞硝酸鈉溶液：稱用0.1M醋酸緩沖液配制濃度為0.05M亞硝酸鈉溶液。2、挑大腸桿菌一環(huán)于5mlLB肉湯中，37℃培養(yǎng)14-16小時。3500r/min，離心5min。棄上清液，打勻沉淀加5mlpH4.6的醋酸緩沖液，二次離心。棄上清液，加現(xiàn)配的HNO21ml混勻，37℃

保溫5min。3、5min后，涂皿（稀釋到10-5）。

CompanyLogo（六）其它化學(xué)誘變劑秋水仙堿誘法細(xì)胞染色體加倍。抑制紡錘絲紡錘體的形成，在染色體復(fù)制完成后無法移向兩極。CompanyLogo抗生素作為誘變劑的主要抗生素有放線菌素、爭光霉素、鏈黑霉素。這些抗生素一般都是抗癌藥物。它們的誘變作用一般沒有烷花劑顯著，常和其它誘變劑搭配使用。金屬鹽類用于誘變的金屬鹽類有LiCl、硫酸錳等。其中LiCl比較常用，同其它誘變劑搭配使用效果顯著。疊氮化物如疊氮化鈉(NaN3)NaN3等電點是pH=4.18,在pH=3時NaN3溶液中主要產(chǎn)生呈中性的分子HN3,易透過膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),以堿基替換方式影響DNA的正常合成,從而導(dǎo)致點突變的產(chǎn)生。