第十一章紫外可見分析法

1第十一章紫外－可見分光光度法藥物分析教研室主要內(nèi)容2第一節(jié)基本原理和概念第二節(jié)紫外可見分光光度計(jì)第三節(jié)紫外可見分光光度分析方法學(xué)習(xí)要求掌握紫外吸收光譜的電子躍遷類型、吸收帶的類型及影響因素；Lambert-Beer定律及其物理意義、適用條件、偏離因素；UV-Vis法用于單組分定量的方法；熟悉紫外-可見分光光度計(jì)的主要部件、工作原理和光路類型；了解紫外-可見分光光度法定性及純度檢查方法。3概述4紫外-可見分光光度法：基于物質(zhì)分子對紫外-可見光區(qū)（200-760nm）輻射的吸收的特性建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。特點(diǎn)：靈敏度可達(dá)10-4-10-6g/ml準(zhǔn)確度0.2%-0.5%5

紫外可見光譜是由分子中價(jià)電子在不同的分子軌道之間躍遷產(chǎn)生的。一、電子躍遷類型第一節(jié)基本原理和概念飽和單鍵的電子不飽和雙鍵的電子未成鍵的n電子（弧對電子）軌道：電子圍繞原子或分子運(yùn)動(dòng)的幾率軌道不同，電子所具有能量不同6反鍵軌道成鍵軌道原子靠近而結(jié)合成分子時(shí)，兩個(gè)原子的原子軌道以線性組合而生成兩個(gè)分子軌道成鍵軌道：能量較低反鍵軌道：能量較高

orbital*orbital

orbital*orbital

n(p)electron躍遷類型：8分子軌道：按能量大?。害摇?>n→σ*>π→π*>n→π*93.電子躍遷類型（1）σ→σ*躍遷：飽和烴（甲烷，乙烷）

E很高，λ<150nm（遠(yuǎn)紫外區(qū)）（2）n→σ*躍遷：含雜原子飽和基團(tuán)(－OH，－NH2)E較大,λ150~250nm(真空紫外區(qū))第一節(jié)基本原理和概念10（3）π→π*躍遷：不飽和基團(tuán)(-C=C-，-C=O)E較小，λ~200nm

體系共軛，E更小，λ更大（4）n→π*躍遷：含雜原子不飽和基團(tuán)（—C≡N，C＝O）

E最小，λ200~400nm（近紫外區(qū)）按能量大小：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*第一節(jié)基本原理和概念

躍遷類型峰位強(qiáng)弱分子基團(tuán)舉例

*<150nm弱飽和烴類

CH3-CH3

(max=135nm)n*-200nm較強(qiáng)含-OH,-NH2CH3Cl-X,-S等(max=215nm=140)

*-200nm強(qiáng)含不飽和鍵CH2=CH2分子(max=165nm

=10-4)

n*200-400nm較弱含有雜原子CH3COCH3不飽和基團(tuán)(max=279nm=10-30)電子躍遷類型12λmax<150200180-200200-400nmΕ

很高較大

>104

10_100按能量大?。害摇?>n→σ*>π→π*>n→π*→*n→*→*n→*CH3—CH3—NH2—OHC=CC=OC=SN=N△E躍遷類型實(shí)例C=O131.吸收光譜（吸收曲線）：不同波長光對樣品作用不同，吸收強(qiáng)度不同，以吸光度A為縱坐標(biāo)，波長λ為橫坐標(biāo)作圖得到的曲線2.吸收光譜特征—定性依據(jù)

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→飽和σ-σ*躍遷產(chǎn)生強(qiáng)吸收不成峰二、相關(guān)的基本概念143.生色團(tuán)（發(fā)色團(tuán)）:能吸收紫外-可見光的基團(tuán)有機(jī)化合物：具有不飽和鍵(π電子)和未成對電子(n電子)的基團(tuán)，產(chǎn)生n→π*躍遷和π→π*躍遷例：

C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：當(dāng)出現(xiàn)幾個(gè)發(fā)色團(tuán)共軛，則幾個(gè)發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收帶將消失，代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶，其波長將比單個(gè)發(fā)色團(tuán)的吸收波長長，強(qiáng)度也增強(qiáng)二、相關(guān)的基本概念154．助色團(tuán)：是指含有非鍵電子的雜原子飽和基團(tuán)，可以使生色團(tuán)吸收峰加強(qiáng)，同時(shí)使吸收峰長移的基團(tuán)如：連有雜原子的飽和基團(tuán)例：—OH，—OR，—NH—，—NR2，—X5．紅移和藍(lán)移：由于化合物結(jié)構(gòu)變化（共軛、引入助色團(tuán)取代基）或采用不同溶劑后

吸收峰位置向長波方向的移動(dòng)，叫紅移（長移）

吸收峰位置向短波方向移動(dòng)，叫藍(lán)移（紫移，短移）二、相關(guān)的基本概念16

6.增色效應(yīng)和減色效應(yīng)增色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的效應(yīng)

減色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)

7.強(qiáng)帶和弱帶：

εmax>104→強(qiáng)帶

εmax<102→弱帶二、相關(guān)的基本概念

吸收帶：吸收峰在紫外-可見光譜中的位置

可分為：R帶、K帶、B帶、E帶、電荷轉(zhuǎn)移吸收帶、

配位體場吸收帶171．R帶：由n→π*躍遷產(chǎn)生含雜原子的不飽和基團(tuán):C＝O；C＝N；—N＝N—弱吸收，εmax<100;λmax250~400nm，溶劑極性增強(qiáng)，短移附近有強(qiáng)吸收峰時(shí)，R帶長移或被掩蓋。三、吸收帶與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系吸收帶：吸收峰在紫外-可見光譜中的位置18三、吸收帶與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系2．K帶：由共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生

(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—一般出現(xiàn)在較短波長區(qū)，210～250nm。②為強(qiáng)吸收，εmax>104③共軛雙鍵增加，吸收峰長移，強(qiáng)度增加。193．B帶：芳香族化合物的主要特征吸收帶

苯λmax

～256nm，寬帶，具有精細(xì)結(jié)構(gòu)；εmax=200極性溶劑中，或苯環(huán)連有取代基，其精細(xì)結(jié)構(gòu)消失三、吸收帶與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系204．E帶：

芳香族化合物的特征吸收帶

E1180nmεmax>104

（常觀察不到）E2200nmεmax=7000

強(qiáng)吸收苯環(huán)被發(fā)色團(tuán)取代且與苯環(huán)共軛時(shí)，E2帶與K帶合并一起紅移（長移），被助色團(tuán)取代E2帶λmax

和ε都變大三、吸收帶與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系211.位阻影響共軛效應(yīng)，吸收帶長移，吸光系數(shù)增加發(fā)色團(tuán)在同一平面，易形成共軛位阻影響分子的平面性

λmax280nm(10500)λmax295.5nm(29000)順式二苯乙烯反式二苯乙烯四、影響吸收帶位置的因素22232.跨環(huán)效應(yīng)有β、γ不飽和醛酮結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)牧Ⅲw排列使R帶長移，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)

四、影響吸收帶位置的因素243.溶劑效應(yīng)（1）對λmax影響：

n-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↓藍(lán)移

π-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↑紅移

四、影響吸收帶位置的因素（2）對吸收光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)影響

溶劑極性↑，苯環(huán)精細(xì)結(jié)構(gòu)消失254.pH值的影響影響物質(zhì)存在型體，影響吸收波長λmax210.5nm,270nmλmax235nm,287nmOH-H+-四、影響吸收帶位置的因素：26五、朗伯-比爾定律透過率：T=It/I0，0<T<1吸光度：A=-lgT1、Lambert定律：A∝l（吸收層厚度）2、Beer定律：A∝C（吸收物質(zhì)濃度）二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A=Ecl27描述物質(zhì)對單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系五、朗伯-比爾定律A：吸光度E：吸光系數(shù)C：溶液濃度l：光路長度A=Ecl281、適用條件：

1)單色光2)稀溶液（10-2～10-5M）2、吸收度的加和性：a、b、c三種物質(zhì)共存時(shí)3、該定律適用于固體、液體和氣體樣品公式討論：294、吸光系數(shù)（E）：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的

吸光度。根據(jù)濃度單位的不同，分為：（1）摩爾吸光系數(shù)ε在一定λ下，c=1mol/L，l=1cm時(shí)的吸光度（2）百分吸光系數(shù)在一定λ下，c=1g/100ml，l=1cm時(shí)的吸光度。（3）兩者關(guān)系公式討論：30吸光系數(shù)的討論1、吸光系數(shù)不隨濃度和光程長度的改變而改變，

僅與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；2、（1）不同物質(zhì)，對同一λ，ε一般不同；（ε↑，吸光能力↑）（2）同一物質(zhì)，對不同λ，ε一般不同（εmax）31例：氯霉素（323.15），λmax=278nm，C=2.00mg/100mlT%=24.3%，l=，1cm,求：,ε32六、偏離Beer定律的因素（一）化學(xué)因素Lambert-Beer定律適用范圍：稀溶液（＜10-2mol/L）溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合與溶劑間的作用等原因,而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象。六、偏離Beer定律的因素

亞甲藍(lán)陽離子水溶液的吸收光譜(a)

6.36×10-6mol/L

(b)

1.27×10-4mol/L(c)5.97×10-4mol/L（一）化學(xué)因素Lambert-Beer定律適用范圍：稀溶液（＜10-2mol/L）溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合與溶劑間的作用等原因,而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象。對此可控制溶液濃度、pH等條件而設(shè)法減免。六、偏離Beer定律的因素36（二）光學(xué)因素a.非單色光

理論要求：平行單色光，實(shí)際：光源復(fù)合光

六、偏離Beer定律的因素照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度，這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度37b.雜散光的影響：

雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值六、偏離Beer定律的因素（二）光學(xué)因素38c.反射光和散射光的影響：

反射光和散射光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光可使透射光減弱，A↑，一般可用空白對比校正消除d．非平行光的影響：使光程↑，l↑，A↑六、偏離Beer定律的因素（二）光學(xué)因素39（三）透光率的測量誤差——ΔT六、偏離Beer定律的因素1）暗噪音：與檢測器和放大電路等各部件的不確切性有關(guān)，與光訊號(hào)無關(guān)，可視為一個(gè)常量。其在A為0.2～0.7范圍內(nèi)，造成相對誤差較小，為測量最適宜范圍。

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訊號(hào)噪音亦稱訊號(hào)散粒噪音。光敏元件受光照射時(shí)的電子遷移，每一單位時(shí)間中電子遷移數(shù)量是不相等的，而是在某一均值周圍的隨機(jī)數(shù)，形成測量光強(qiáng)時(shí)的不確定性。隨機(jī)數(shù)變動(dòng)的幅度隨光照增強(qiáng)而增大，與光的波長及光敏元件的品質(zhì)有關(guān)。

2）訊號(hào)噪音：與光訊號(hào)有關(guān)（三）透光率的測量誤差——ΔT六、偏離Beer定律的因素41

第二節(jié)紫外-可見分光光度計(jì)4243一、基本組成光源單色器吸收池檢測器顯示器1.光源

鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm氫燈或氘燈——紫外光源200~400nm2．單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件44

棱鏡——對不同波長的光折射率不同色散元件分出光波長不等距光柵——衍射和干涉分出光波長等距3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致）464．檢測器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置5．訊號(hào)處理與顯示器：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)光電池光電管光電倍增管二極管陣列檢測器47二、分光光度計(jì)的類型1．單光束分光光度計(jì)：特點(diǎn)：使用時(shí)來回拉動(dòng)吸收池→移動(dòng)誤差對光源要求高比色池配對(一)幾種光路類型482．雙光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池，可以減小移動(dòng)誤差對光源要求不高可以自動(dòng)掃描吸收光譜493．雙波長分光光度計(jì)特點(diǎn)：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差504．光多道二極管陣列檢測分光光度計(jì)5152(二)光學(xué)性能1.波長范圍：190-1100nm2.波長準(zhǔn)確度：儀器顯示波長與實(shí)際波長之差≤±0.3nm3.波長重現(xiàn)性：≤±0.2nm4.透光率范圍：0-300%5.吸光度測量范圍：-0.447～+3.006.光度準(zhǔn)確度：≤±0.3%7.光度重復(fù)性：≤±0.3%8.分辨率：單色器分辨兩條靠近的譜線的能力.260nm，△λ=0.3nm9.雜散光：220nm處（1%NaI）≤0.1%53(三)儀器的校正1.波長的校正氫燈或氘中的較強(qiáng)譜線486.13nm(F線)和656.28nm（C線）稀土玻璃（鐠釹、鈥）、某些元素（汞、鉀、銫）苯蒸汽檢查和校正波長讀數(shù)。542.吸光度的校正60mg重鉻酸鉀用0.005mol/L的硫酸溶液稀釋至1000ml，在規(guī)定波長處測定并計(jì)算吸收系數(shù)，與規(guī)定值比較。規(guī)定值：235nm123.0～126.0257nm142.8～146.2313nm47.0～50.3350nm105.5～108.53.吸收池校正

兩吸收池測定的差值小于1%55一、定性分析二、定量分析定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測定單組分的定量方法多組分的定量方法第三節(jié)紫外－可見分光光度分析方法三、結(jié)構(gòu)分析56（一）單組分的定量方法

1．吸光系數(shù)法

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線法

3．對照法：外標(biāo)一點(diǎn)法注意:1）選擇吸收光譜中的吸收峰對應(yīng)的波長

2）多個(gè)吸收峰，選擇無干擾的、較高的峰

3）測定波長大于溶劑的截止波長二、定量分析571．吸光系數(shù)法（絕對法）例：維生素B12

的水溶液在361nm處的百分吸光系數(shù)為207，用1cm比色池測得某維生素B12溶液的吸光度是0.414，求該溶液的濃度?解：二、定量分析例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測定吸光度為0.507，求B12的百分含量？

已知361nm處的百分吸光系數(shù)為207解：592．標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定波長下分別測定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，繪制A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線。并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的被測溶液濃度或含量。BlankStandardSampleSample二、定量分析60示例

蘆丁含量測定