乙酰膽堿酯酶抑制劑課件

HPLC-UV-ESI-MS-TLC聯(lián)用篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑答辯人：朱桃玉指導老師：馬志玲副教授目錄前言實驗結果與討論結語與展望第一部分前言選題意義研究現(xiàn)狀實驗策略創(chuàng)新之處1.2經(jīng)典研究方法先導藥物

合成

分離提純

測定生物活性

主要合成產(chǎn)物副產(chǎn)物易提純體系難提純體系

經(jīng)典方法的局限性：

1)只適合易提純體系；2)只注重主要合成產(chǎn)物的信息

？？1.3實驗策略合成混合物二維TLC分離檢測混合物條件優(yōu)化最佳展開劑的確定最小檢測量的確定測定抑制活力HPLC定量分離定量條件優(yōu)化pH的影響離子對試劑的影響三乙胺的影響LC-MS定性借助氫譜結論1.4創(chuàng)新之處合成產(chǎn)物的混合體系不經(jīng)提純直接進行篩選，特別適合難提純體系對合成過程中的副產(chǎn)物進行篩選，從而獲得更多有用信息實現(xiàn)了各種色譜方法的聯(lián)用發(fā)展了多維薄層色譜法分離同分異構體，同時在薄層板上檢測其生物活性2.1研究體系主要合成路線氫譜圖質(zhì)譜圖紅外圖譜2.2儀器TLCaluminiumsheetsSilicagel60F254(merck公司）可調(diào)式移液器（Thermolabsystems,0.5～10μL）1100型高效液相色譜儀（Aligent公司），配有二級管陣列檢測器，化學工作站（AgilentChemStationforLC3D）液相－質(zhì)譜聯(lián)用儀（ThermoFinigan公司），配有ESI離子源，化學工作站2.3主要試劑乙酰膽堿酯酶抑制劑混合物（合成產(chǎn)物）乙酰膽堿酯酶（Sigma公司）氯化乙酰膽堿（Sigma公司）5，5－二巰基雙－2－硝基苯甲酸（Sigma公司）展開劑體系第一維：三氯甲烷：甲醇＝9：1；0.4mL0.1mol/L的三乙胺甲醇溶液；0.3mL0.1mol/L的HCl甲醇溶液；1.0mL10mmol/L的十二烷基硫酸鈉甲醇溶液。流動相走過的距離為5.3cm；第二維：三氯甲烷：甲醇＝9：1，流動相走過的距離為8.0cm兩維之間的干燥時間：5min2.41二維薄層色譜法分離混合物2.42二維薄層色譜法測定抑制活力取2.5μL樣品溶液點板，在二維展開劑體系展開。逐次噴上氯化乙酰膽堿溶液、DTNB溶液，待硅膠板干燥后噴上新鮮的酶液。5分鐘后觀察現(xiàn)象。分別配制2～0.05mmol/L

的樣品溶液，依照上述方法，測定該方法的最小檢測量實驗結果結論：用薄層色譜法可以鑒別出具有抑制能力的化合物。同時，可以粗略地測出各種化合物的抑制能力的大小。混合物經(jīng)二維TLC的分離結果最小檢測量的測定結果1：2mmol/L2:1mmol/L3:0.5mmol/L4:0.2mmol/L5:0.1mmol/L6:0.05mmol/L離子對試劑的影響

改變十二烷基苯磺酸鈉溶液的濃度，按照同一梯度進行測定。觀察其濃度對于分離的影響。結論：加入了離子對試劑后，各組分由于分子的空間結構不同，從而在固定相上的保留不同，進而得以分離。我們采用的十二烷基苯磺酸鈉的濃度為30mmol/L未加入三乙胺100：2100：4100：6結論：從上圖可以看出三乙胺的加入可以改善峰型的拖尾。當1％甲酸－三乙胺＝100：4時，各種化合物已經(jīng)基本達到分離；當繼續(xù)增加三乙胺的量，分離又逐漸變差。本實驗采用的1％甲酸－三乙胺的比例為100：4。三乙胺的影響色譜條件色譜柱：HypersilODS2C184.6mm×50mm5um檢測波長：426nm流速：1ml/min進樣量：20μL流動相：甲醇；1％甲酸－三乙胺＝100：4；30mmol/L十二烷基苯磺酸鈉采用以下淋洗梯度進行分離測定實驗結果混合物經(jīng)HPLC的分離結果HPLC三維色譜圖混合物中各種物質(zhì)的相對含量①②③④⑤2.33液相－質(zhì)譜確定分子結構色譜條件：色譜柱：HypersilBDSC182.1mm×50mm3um

毛細管溫度：350℃噴射電壓：3500V輔氣：鞘氣進樣量：20μL流動相：甲醇、1％甲酸

梯度條件

t/minA%B％059561090127030251000其中，A為甲醇；B為1％甲酸結論①②其中，①、②、③、⑤分別為保留時間9.275、11.775、13.080、20.066所