動物與家蠶的轉基因技術

轉基因技術第一頁，共四十八頁。轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術（Transgenetechnology）。人們常說的"遺傳工程"、"基因工程"、"遺傳轉化"均為轉基因的同義詞。經(jīng)轉基因技術修飾的生物體在媒體上常被稱為"遺傳修飾過的生物體"（Geneticallymodifiedorganism，簡稱GMO）。第二頁，共四十八頁。

GeneticallyModified——轉基因，簡稱GM。是指運用科學手段從某種生物中提取所需要的基因，將其轉入另一種生物中，使與另一種生物的基因進行重組，從而產(chǎn)生特定的具有變異遺傳性狀的物質。利用轉基因技術可以改變動植物性狀，培育新品種。也可以利用其它生物體培育出期望的生物制品，用于醫(yī)藥、食品等方面。

第三頁，共四十八頁。

轉基因動物就是基因組中含有外源基因的動物。它是按照預先的設計，通過細胞融合、細胞重組、遺傳物質轉移、染色體工程和基因工程技術將外源基因導入精子、卵細胞或受精卵，再以生殖工程技術，有可能育成轉基因動物。通過生長素基因、多產(chǎn)基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生蟲基因、抗病毒基因等基因轉移，可能育成生長周期短，產(chǎn)仔、生蛋多和泌乳量高，轉基因超級鼠比普通老鼠大約一倍。生產(chǎn)的肉類、皮毛品質與加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、豬、雞、魚等家養(yǎng)動物中取得一定成果。

轉基因動物第四頁，共四十八頁。1.轉基因綿羊第五頁，共四十八頁。2.轉基因鯉魚第六頁，共四十八頁。1．轉基因動物的發(fā)展1980年，J.W.Gordon等人首次報道用顯微注射的方法向小鼠胚胎注射純化的DNA，開辟了轉基因動物研究的先河。1982年，R.D.Palmiter等又報道用轉移生長激素基因的方法，獲得了7只轉基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被稱為巨鼠，引起極大的轟動。相繼有轉基因豬、魚、兔和羊等問世。第七頁，共四十八頁。第八頁，共四十八頁。國外轉基因動物首創(chuàng)記錄

年份研究者基因/轉入方法轉入動物結果1980GordonHSV-TK小鼠78只子鼠中有2只為轉基因鼠1981Constantini兔珠蛋白基因小鼠24只子鼠中9只為轉基因鼠1982Palmiter將MT啟動子和大鼠GH基因接成的融合基因侏儒小鼠7只轉基因中1只生長加快，明顯增大1985Wagner拼接有NEO基因的逆轉錄病毒小鼠獲得整合體小鼠1985Hammer制備轉基因兔、羊、豬均獲得成功1986RobertsonMPSA-mos-Neo逆轉錄病毒感染ES細胞得到可遺傳的轉基因動物1987Thomas利用ES細胞法結合同源重組技術小鼠制備出Hprt基因定點突變的轉基因小鼠1988Biery牛轉基因牛成功1990Hochi大鼠轉基因大鼠成功1994Love線性質粒雞7只雞活到性成熟，1只公雞給后代傳遞外源基因1994Ono基因微注射鵪鶉有46.6%胚體表達了外源基因1998Wilmut綿羊乳腺細胞綿羊體細胞核克隆，獲得綿羊“多利”第九頁，共四十八頁。年份單位及研究者基因/轉入方法轉入動物結果1984發(fā)育所陸德裕等人珠蛋白小鼠個體大，基因可連續(xù)傳遞，但表型似不能保持1986發(fā)育所史瀛仙等牛及人生長激素小鼠DNA能轉錄成RNA的小鼠體型大，未能轉錄成RNA的小鼠體積小，說明基因在體內一定要轉錄成RNA，并翻譯成蛋白質，才能起促進生長的作用。1987發(fā)育所于建康等大腸桿菌galk基因小鼠產(chǎn)21只，2只DNA中含有大腸桿菌galk基因1995北京農(nóng)大陳永福等ZPL線性化的DNA導入豬受精卵豬獲轉基因豬，為避免豬過早死亡，采用傳代、后誘導表達法1996中國農(nóng)科院畜牧所黃少華等微注射SMT-PGH基因到豬早期胚胎豬妊娠率隨移入胚胎數(shù)的增多而提高，以20-30為宜1997江蘇農(nóng)科院范必勤等用體外獲能的精子為載體，通過體外受精導入基因豬建立新的基因導入方法1998上海醫(yī)學遺傳研究所曾溢滔等人凝血因子山羊產(chǎn)出5只轉基因羊，其中1只母羊乳汁中含有人凝血因子1999上海醫(yī)學遺傳研究所曾溢滔等人血清蛋白奶牛移植8頭牛，妊娠3頭，生產(chǎn)1頭公牛，攜帶有人血清蛋白基因國內轉基因動物首創(chuàng)記錄

第十頁，共四十八頁。⑴經(jīng)典的技術路線

先從已交配的供體動物的輸卵管中采取受精卵；顯微注射法向受精卵的雄性核導入人工構建的藥物蛋白基因；經(jīng)外科手術把已導入外源基因的受精卵移入同步發(fā)情的受體母羊輸卵管內；讓受精卵在“養(yǎng)母”體發(fā)育至分娩出生；用分子生物學技術檢測出生小羊是否已整合了導入的外源基因。該法的缺點：實驗周期長，注射的外源基因整合率低。3.轉基因動物的技術路線第十一頁，共四十八頁。⑵整合胚胎移植技術路線

該技術是對前種方法的改進。它利用了生殖技術中的體外受精技術，使精子和卵子在體外受精；然后找到一個最佳時機向體外受精的細胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體外對胚胎體進行整合的鑒定。從中挑選有目的基因整合的胚胎進行移植。采用經(jīng)陰道的非手術胚胎移植法，減少了對受精卵的損傷。第十二頁，共四十八頁。第十三頁，共四十八頁。⑶核移植（克?。┘夹g路線

利用克隆技術進行轉基因實驗。即在進行克隆之前，先目的基因注射到將進行移植的核中，在按克隆技術進行操作。其成功率比經(jīng)典技術路線高2.5倍。⑷整合卵受精技術路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進入卵細胞，經(jīng)檢測已經(jīng)完成整合后，再進行體外受精和胚胎移植。第十四頁，共四十八頁。第十五頁，共四十八頁。

A.互補DNA(cDNA)的克隆

通過提取組織中的mRNA,用反轉錄酶合成cDNA，建立cDNA文庫，再克隆目標蛋白的cDNA。由于cDNA缺乏內含子，影響基因導入后的表達效率。B.DNA克隆

首先建立動物的DNA文庫，再通過基因克隆技術獲得編碼目標蛋白的基因，這是獲得目標基因最常用的方法。目標基因被克隆以后需與表達載體相連結，形成一個獨立表達的調控單元，再通過擴增和純化，使DNA達到一定濃度就可用于基因導入受體。目前獲得目標基因的途徑有兩種方法：第十六頁，共四十八頁?；驅氲姆椒?/p>

A.反轉錄病毒感染法(retrovirusinfection)B.顯微注射法(microinjection)C.胚胎干細胞法(EScelltransfermethod)D.精子載體法(Sperm-mediatedgenetransfer)E.生殖細胞轉染法(Germcelltransfected)F.細胞核移植法(Cellnucleartransfer)第十七頁，共四十八頁。A.反轉錄病毒感染法

反轉錄病毒是雙鏈RNＡ病毒，它侵染細胞后可通過自身的反轉錄酶以RNA為模板在寄主細胞染色體中反轉錄成DNA。在利用病毒載體轉基因時，首先要對病毒基因組進行改造，將外基因插入到病毒基因組致病區(qū)，然后用此病毒感染胚胎細胞，即可對胚胎細胞進行遺傳轉化。如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中，可獲得轉基因動物，在第一次卵裂之后整合，會產(chǎn)生嵌合體，其第二代可能出現(xiàn)轉基因動物。

優(yōu)點:方法簡單，效率高，外源DNA在整合時不發(fā)生重排，單位點、單拷貝整合，并且不受胚胎發(fā)育階段的限制。缺點:攜帶外源基因的長度不超過15kb，載體病毒基因有潛在致病性，威脅受體動物的健康安全。第十八頁，共四十八頁。第十九頁，共四十八頁。B.顯微注射法(microinjection)

第二十頁，共四十八頁。第二十一頁，共四十八頁。C.胚胎干細胞法

這種方法首先是用外源基因轉化胚胎干細胞，通過篩選，把陽性細胞注入受體動物的囊胚腔中，生產(chǎn)嵌合體動物，當胚胎干細胞分化為生殖干細胞時外源基因可通過生殖細胞遺傳給后代，在第二代獲得轉基因動物。優(yōu)點:對陽性細胞進行選擇，實現(xiàn)外源DNA的定點整合。缺點:第一代是嵌合體，獲得轉基因動物的周期較長。第二十二頁，共四十八頁。第二十三頁，共四十八頁。D.精子載體法

它是利用哺乳動物的精子能結合外源DNA的特性，通過受精過程把外源DNA導入受精卵，獲得轉基因動物。優(yōu)點:方法簡單，轉基因效率高。缺點:效果不穩(wěn)定，外源DNA分子可能會受到受精液中內切酶的作用而影響整合后的功能。第二十四頁，共四十八頁。第二十五頁，共四十八頁。E.生殖細胞轉染法

第二十六頁，共四十八頁。F.細胞核移植法

這種方法是隨著哺乳動物體細胞核移植技術的發(fā)展而建立的。首先用外源DNA對培養(yǎng)的體細胞或胚胎干細胞進行傳染，然后選擇陽性細胞作核供體，通過細胞核移植，獲得基因動物。這種方法是非常理想的轉基因手段，因為它可與基因靶技術結合，實現(xiàn)外源基因的定點整合，消除外源DNA隨機整合帶來的負作用。這種方法的轉基因效率可達100%，大大降低轉基因家畜的生產(chǎn)成本。第二十七頁，共四十八頁。第二十八頁，共四十八頁。檢測的方法A.外源基因的整合檢測它是檢測動物基因組中是否攜帶外源DNA。常用的方法是用目標基因的一段序列作引物，PCR儀擴增目標DNA，再通過電泳初步檢測是否含有目標基因。然后，用Southern雜交檢測PCR陽性個體是否含有目標基因，如果出現(xiàn)陽性，就可斷定為轉基因陽性動物。B.外源基因的轉錄檢測它是用Northern雜交法對轉基因動物某一組織的mRNA進行分析檢測，出現(xiàn)陽性表明外源基因具有轉錄活性。C.外源基因的表達檢測它是檢測轉基因動物組織中是否含有目標基因編碼的外源蛋白質，常用的方法有酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法和Western雜交法。第二十九頁，共四十八頁。第三十頁，共四十八頁。轉基因動物的應用

在醫(yī)學上

A.制備動物疾病模型與疾病相關的基因被克隆后,通過轉基因技術制備動物疾病模型,可用來研究疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和治療藥物的篩選,以此確定確定此疾病的最佳治療方案。目前，在世界范圍內發(fā)現(xiàn)人類的遺傳疾病有3500多種,已建立約15種轉基因疾病模型，其中包括糖尿病、高血脂癥、β－地中?；蜱牭缎拓氀Y，阿爾茨海默氏病(Alzheimer’sDisease),動脈粥樣硬化癥等常見的疾病。第三十一頁，共四十八頁。B.用以研究癌基因的活動規(guī)律和腫瘤的發(fā)生機理。如SV40的啟動子與胰島素或晶狀體蛋白基因重組后,制備的轉基因動物出現(xiàn)胰腺瘤或晶狀體瘤,進一步研究發(fā)現(xiàn)SV40啟動子的72個核苷酸與腫瘤的發(fā)生有密切關系,已建立乳腺癌和前列腺癌的小鼠。C.用以治療遺傳疾病隨著人類基因組計劃的完成和基因定點整合技術的成熟，轉基因技術有可能治愈人類的遺傳疾病。D.生產(chǎn)人的代用器官用表達病人補體調節(jié)蛋白基因或敲除細管內皮細胞表面抗原決定簇基因豬的器官可替代人的患病器官,延長病人的壽命。第三十二頁，共四十八頁。家蠶篇第三十三頁，共四十八頁。轉基因家蠶所用載體轉基因載體是一類裝載有外源DNA并使其隨自身復制而得到擴增的DNA構造,并且具有可以將所攜帶的外源基因在一定條件下插入到宿主基因組中的功能,轉基因載體包括一些固有的元件,如啟動子、轉座序列等,進行家蠶轉基因操作,除了應注意目的基因的導入方法和導入時期外,選擇合適的啟動子和構建合適類型的載體也是技術的關鍵。第三十四頁，共四十八頁。轉基因家蠶載體中所用啟動子選擇合適的啟動子也是成功表達外源基因的關鍵因素之一,啟動子是位于一個基因上游的一段DNA序列,它含有蛋白質(轉錄因子和RNA聚合酶)的結合位點,目前家蠶轉基因多采用家蠶體內廣泛存在的肌動蛋白A3啟動子和多角體病毒極早期蛋白E1啟動子。第三十五頁，共四十八頁?；谵D座子的載體目前應用于轉基因家蠶研究最多的是piggyBac轉座子,它也是昆蟲生殖系轉化使用最廣泛的轉座子,piggyBac轉座系統(tǒng)常作為家蠶轉基因研究采用的有效載體,第三十六頁，共四十八頁。piggyBac轉座子的結構第三十七頁，共四十八頁。基于病毒的載體:

用于家蠶基因工程的桿狀病毒主要有家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV),既可用于家蠶的種系轉移,又可用于瞬時表達,該方法是將外源基因插入到桿狀病毒特定位點,得到重組病毒,通過重組病毒與家蠶基因組之間的同源重組將外源基因整合到家蠶基因組。第三十八頁，共四十八頁。基因打靶載體

基因打靶技術以同源重組為基礎,通過同源重組將外源基因定向地融合進靶細胞基因組中的某個位點,自20世紀80年代后興起,人為地對某一預先確定的靶位點進行定點突變,可以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的。與piggyBac轉座子相比,其突出的優(yōu)點是克服了隨機整合的盲目性和危險性,因此是一種理想的修飾和改造生物遺傳物質的方法。第三十九頁，共四十八頁。關于家蠶-基因導入的方法

A.反轉錄病毒感染法(retrovirusinfection)B.顯微注射法(microinjection)C.胚胎干細胞法(EScelltransfermethod)D.精子載體法(Sperm-mediatedgenetransfer)E.生殖細胞轉染法(Germcelltransfected)F.細胞核移植法(Cellnucleartransfer)第四十頁，共四十八頁。轉基因家蠶的應用研究

研究基因功能:在家蠶的全基因組框架圖完成之后,目前的主要工作是對家蠶基因組計劃所獲得的大量基因進行研究,以探索其具體的生物學功能,由于轉基因技術可以實現(xiàn)家蠶功能基因的過量表達或者基因功能的缺失,因此將成為研究家蠶基因功能的重要方法之一。要最終鑒定基因功能,最理想的方法是將分離的基因導入家蠶體內,在個體水平上驗證其是否具有功能,特別是對于功能基因組學研究來說,不僅要確定序列的編碼區(qū)和非編碼區(qū),還要鑒定相關的生物功能,因此只有轉基因方法才能最終使我們認識所有不同序列的功能特征,轉基因家蠶有助于研究家蠶系統(tǒng)發(fā)育調控以及基因群的相互作用。第四十一頁，共四十八頁。研究基因的表達機制:

將家蠶基因的啟動子或增強子序列和lacZ融合基因做成轉基因家蠶,通過調查lacZ基因的表達,研究基因的表達機制。不同的蠶品種,其內部生理環(huán)境各不相同,生化代謝與調控也存在一定的差異,因此以不同品種的家蠶為對象進行轉基因研究,所獲得的轉基因蠶中外源基因的表達水平有可能存在差異,通過轉基因技術可以尋找易于表達外源基因的家蠶品種,從而為轉基因家蠶的進一步應用提供參考。第四十二頁，共四十八頁。改善蠶絲品質:家蠶絲是一類性能優(yōu)良的天然蛋白纖維,但卻在抗皺性、耐磨性、固色性、滌特性等方面存在不足,而天蠶絲和蜘蛛絲的許多性能均優(yōu)于家蠶絲,蜘蛛太具攻擊性而不能飼養(yǎng)。所以許多研究人員一直致力于使用基因工程方法構建轉基因家蠶用以突破傳統(tǒng)育種的限制,通過人工構建蜘蛛絲、天蠶絲等蛋白的基因,并將其導入家蠶中,獲得具有優(yōu)良絲質性狀的家