土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課件

土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課件.演示文稿第一頁(yè)，共二十八頁(yè)。（優(yōu)選）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課件第二頁(yè)，共二十八頁(yè)。一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O第三頁(yè)，共二十八頁(yè)。3、常見(jiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照第四頁(yè)，共二十八頁(yè)。

1、實(shí)例：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株第五頁(yè)，共二十八頁(yè)。要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；配置合適的培養(yǎng)基方法：⑴抑制大多數(shù)微生物生長(zhǎng)⑵造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)稀釋涂布平板法等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。第六頁(yè)，共二十八頁(yè)。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？從功能上屬于哪類(lèi)培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養(yǎng)基第七頁(yè)，共二十八頁(yè)。培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第八頁(yè)，共二十八頁(yè)。1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第九頁(yè)，共二十八頁(yè)。2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。第十頁(yè)，共二十八頁(yè)。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。第十一頁(yè)，共二十八頁(yè)。設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對(duì)照：設(shè)置對(duì)照的方法：空白對(duì)照：不給對(duì)照組任何處理因素。條件對(duì)照：給對(duì)照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素，但不是所要研究的處理因素。自身對(duì)照：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對(duì)象上進(jìn)行。相互對(duì)照：不單設(shè)對(duì)照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照。

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。第十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。第十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第十四頁(yè)，共二十八頁(yè)?！魬?yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板[三]樣品的稀釋第十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類(lèi)微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線(xiàn)菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)論：為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第十七頁(yè)，共二十八頁(yè)。㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線(xiàn)菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第十八頁(yè)，共二十八頁(yè)。微生物的培養(yǎng)與觀察第十九頁(yè)，共二十八頁(yè)。三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30—300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第二十頁(yè)，共二十八頁(yè)。四、操作提示

無(wú)菌操作

做好標(biāo)記

規(guī)劃時(shí)間

第二十一頁(yè)，共二十八頁(yè)。五.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過(guò)記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。第二十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。大腸桿菌呈黑色中心,有或無(wú)金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征

第二十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。本課題知識(shí)小結(jié):第二十四頁(yè)，共二十八頁(yè)。六、例題解析

例1．對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是A．在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B．至少接種一種細(xì)菌C．接種一個(gè)細(xì)菌D．及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)解析：細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定是人們?cè)谝欢l件下進(jìn)行的。這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測(cè)定出細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律。測(cè)定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長(zhǎng)；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過(guò)樣品推測(cè)細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭(zhēng)而不能測(cè)定一種微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。答案：A第二十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。例2．在微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭(zhēng)最顯著最激烈的時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對(duì)數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期

解析：種內(nèi)斗爭(zhēng)是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭(zhēng)反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭(zhēng)奪。在生活空間充裕，營(yíng)養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭(zhēng)的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來(lái)越少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越來(lái)越少，每個(gè)個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭(zhēng)奪也越來(lái)越激烈，種內(nèi)斗爭(zhēng)就越來(lái)越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭(zhēng)最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開(kāi)始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭(zhēng)主要是與無(wú)機(jī)環(huán)境的斗爭(zhēng)。答案：C第二十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.至少接種一種細(xì)菌

C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()

A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練A

CD第二十七頁(yè)，共二十八頁(yè)。4.下列說(shuō)法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌